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猪瘟是危害养猪业的重要疾病之一。猪瘟病毒(CSFV)C-株是世界范围内公认的免疫性能良好的弱毒疫苗株。为探讨CSFV C-株组织毒在SK-6 细胞上的嗜性及其检测方法,以CSFV C-株兔脾组织毒为对象,以SK-6 细胞作为病毒宿主,借助直接荧光抗体染色、夹心ELISA 和RT-PCR 等方法研究了病毒抗原的表达并检测了病毒核酸序列,结果表明,C-株兔脾组织毒可在SK-6 细胞中低水平增殖和表达。ELISA 法和RT-PCR 法适于检测CSFV 弱毒疫苗株,但直接荧光抗体染色法不宜用于CSFV 弱毒疫苗株的检测。该研究为CSFV 弱毒疫苗株的检测提供了一定指导,为C-株兔脾组织毒在SK-6 细胞中的增殖培养奠定了基础,也为CSFV 的逆向遗传学研究提供了基础条件。经过测序发现本研究室前期构建的CSFV 全长cDNA 分子中存在几个致死性突变位点,致使该cDNA 缺乏感染性,为了恢复其感染性,采用RT-PCR、Nested PCR 和Half-nested PCR 技术从实验感染兔脾组织的总RNA 中得到了CSFV C-株全长cDNA 的3 个待改造片段,分别克隆于pMD18-T 载体后进行测序。用重组技术分别从前期构建的5’半长cDNA或3’半长cDNA 中替换F1、F3 和F51,构建成两个新的半长cDNA,进一步连接成新的全长cDNA,经测序证实全长cDNA中3个致死性突变位点均得到改正。借助脂质体转染技术转染SK-6 细胞,检测了CSFV 的抗原表达和特异性核酸序列,结果表明该全长cDNA 具有感染性。成功地建立了CSFV C-株反向遗传操作系统,为从事CSFV 分子生物学研究提供了重要的技术平台。本研究进一步利用该感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因作为标记基因,通过基因工程技术插入CSFV Npro基因的起始密码子ATG 后,借助脂质体转染SK-6 细胞,检测了包含PRRS 病毒GP5 基因的一段重组序列及CSF 病毒的抗原表达,结果表明GP5 基因在细胞连续传代5 到10 代后仍然稳定的插入在CSFV的序列中,培养细胞中存在猪瘟抗原,由于构建的重组病毒可通过检测GP5 区段的特异序列区别于猪瘟野毒,另外,标记基因为PRRSV 的主要抗原基因,因而该重组体可望作为CSFV C-株活病毒标记疫苗,用于CSF 和PRRS 的免疫预防。