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人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）是指来源于人囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）或人原始生殖细胞（human primordial germ cells）的多能性细胞，它在体外能无限增殖并保持正常的细胞核型，具有分化为三个胚层的各种组织的潜能。hESCs系的建立对再生医学、药理学及基础科学研究具有深远的应用价值。目前，许多研究机构都在进行hESC建系的相关研究工作。大多数生殖中心在进行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）时通常使用D3的胚胎进行移植，移植后常有许多剩余质量差的废弃胚胎，将这些D3废弃胚胎收集起来进行培养，部分胚胎可发育成囊胚，本实验利用这些囊胚的内细胞团，以人胚胎肺组织成纤维细胞（human embryonic pulmonary fibroblasts，HEPFs）作为饲养层，进行了hESC建系及鉴定的初步研究。还有一部分患者已妊娠分娩成功，她们自愿签署知情同意书，将其多余的冷冻胚胎用于科学研究，本实验将这些胚胎解冻后进行培养，部分也可发育成囊胚，对其也进行了hESCs建系及鉴定的相关研究。hESCs建系成功后的另一个重要环节就是细胞的有效冻存，本实验采用慢速冷冻、玻璃化冷冻及程序降温冷冻三种不同方法冻存同一代数的hESCs，并将解冻后hESCs的细胞复苏率、克隆生长及分化情况进行对比分析，同时对解冻后的hESCs的全能性进行了鉴定。研究分为三部分：第一部分，应用体外受精废弃胚胎建立hESCs系；第二部分，对所建立hESCs系的鉴定；第三部分，hESCs低温冻存方法比较。本实验共收集了177个D3废弃胚胎，形成囊胚47个；解冻胚胎23个，形成囊胚7个。hESCs系的建立与囊胚的质量和ICM所形成的原代克隆的生长情况密切相关，质量好的囊胚分离培养获得的hESCs传代效率高，原始生长速度快的ICM所形成的原代克隆传代效率高。我们将来源于优质囊胚的ICM接种于饲养层后已经建立了4个hESCs系，分别命名为hESCs-060909、hESCs-060927、hESCs-061005和hESCs-061124，其中hESCs-061124来源于解冻胚胎形成的优质囊胚。hESCs系的鉴定包括对hESCs的细胞形态、表面标记物（alkaline phosphatase，TRA-1-60，TRA-1-81，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4）及核型的鉴定。我们对hESCs-060909 P20，hESCs-060927 P15，hESCs-061124 P6进行了AKP检测，克隆呈紫红色阳性反应。对hESCs-060909 P20和hESCs-060927 P15进行了免疫组化检测：未分化的hESCs克隆SSEA-1不着色，呈阴性反应；SSEA-3染色较浅，呈部分阳性反应；SSEA-4染色深，呈阳性反应；TRA-1-60呈阳性反应。对hESCs-060909 P20进行了核型检测，核型为46，XY，表明其具有正常的二倍体核型；对hESCs-060927 P15进行了核型检测，核型为46，XX，表明其具有正常的二倍体核型。本实验探讨了三种不同方法冷冻保存hESCs的效率。将传统慢速冷冻、玻璃化冷冻及程序降温冷冻三种方法冻存的hESCs解冻后进行比较，分析了不同方法对hESCs的细胞复苏率、克隆生长和分化情况的影响。用机械法将培养皿中同一细胞系同代的hESCs进行分离，共获得93个相似大小的hESCs细胞团块，将其分为三组冻存：31个进行慢速冷冻，31个进行玻璃化冷冻，其余31个进行程序化冷冻。一周后将冻存的hESCs解冻，对不同冻存方法的hESCs复苏率（复苏率=回收细胞团块数目／冷冻细胞团块数目）进行对比：玻璃化法组复苏率为35.5％，程序化冷冻组复苏率为16.1％，慢速冷冻组的复苏率为12.9％。其中玻璃化法组与慢速冷冻组相比较，有统计学意义（P＜0.05），认为玻璃化法能更有效的保存人胚胎干细胞。其余两两比较，均无统计学意义。我们也将应用三种冻存方法解冻后的hESCs的细胞形态，克隆生长和分化情况进行了对比，玻璃化法组比其它两组的hESCs形态好，克隆生长速度较快且不易分化。最后，我们对解冻后的hESCs的全能性进行了鉴定，三组解冻后的hESCs核型分析正常，AKP阳性，SSEA-1阴性，SSEA-3部分阳性，SSEA-4阳性。