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海藻糖是一种高度安全的非还原性二糖,对生物体或生物大分子具有良好的非特异性保护作用;也可以作为生物体的结构组成成分,参与某些微生物细胞壁的组成;同时,海藻糖又可作为碳源和能源物质。因此,海藻糖被广泛应用于医药、食品、化妆品和农业等领域。源于S.acidocaldarius ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC 5.4.99.15）是以淀粉为原料生产海藻糖的关键酶之一,但是该酶存在酶活力较低的缺点,不利于工业化应用。为此,本研究构建了一种适合用于MTSase突变文库的高通量筛选方法,并在此基础上利用定向进化提高了源于S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase的酶活力。主要研究结果如下:（1）探究了不同底物浓度对高通量筛选方法的影响,建立了以0.2%（w/v）的麦芽糊精溶液作为底物的MTSase的高通量筛选体系;探究了构建MTSase突变文库的易错PCR体系,发现当PCR体系中Mn2+和Mg2+的终浓度分别为0.4 mmol?L-1和5.0mmol?L-1,突变文库的突变频率最为合适;在此基础上,以MTSase的基因tre Y作为模板,进行易错PCR后,构建重组质粒pET-24a（+）-treY,导入E.coli BL21（DE3）,构建MTSase突变文库。（2）基于构建的筛选体系对MTSase的突变文库进行第一轮筛选,获得3个酶活提高较为显著的突变体,分别是F-7、E-3和D-6,其摇瓶发酵酶活分别为50.64 U?mL-1、40.51 U?mL-1和41.22 U?mL-1,是野生型MTSase酶活的1.90、1.52、和1.54倍;同时,对野生型MTSase及各个突变体进行分离纯化和酶学定性,结果表明:突变体同野生型的最适pH均为6.0;在pH 5.5-9.0,突变体的稳定性同野生型相似;突变体同野生型MTSase的最适温度均在60-70℃,60℃的半衰期均在14 d以上;突变体同野生型MTSase相比,动力学常数(Km和kcat)各有差异,对底物的催化效率均有所提高。（3）以第一轮筛选获得酶活最高且酶学性质没有明显改变的突变体F-7的基因作为模板,进行第二轮的定向进化,获得一个酶活提高的突变体D-4,其摇瓶发酵酶活为63.96 U?mL-1,是野生型的2.40倍;对突变体D-4进行分离纯化和酶学定性,结果表明:突变体D-4的最适pH为6.0;在pH 5.5-9.0条件下,突变体D-4的稳定性与野生型相似;最适温度为60℃;60℃的半衰期在14 d以上;同野生型相比,突变体D-4对底物的亲和性有所提高,其催化效率为野生型的2.33倍。（4）根据突变体基因序列分析结果结合定点突变技术,发现第284位和第439位是导致酶活提高的关键位点,当这两个位点的苯丙氨酸和苏氨酸分别突变为缬氨酸和丙氨酸后,其突变体的摇瓶发酵酶活分别是野生型MTSase的1.45倍和1.50倍。并通过分子对接和分子模拟对突变位点进行分析,酶活提高可能原因是疏水相互作用和极性相互作用的减弱,使得催化残基Asp443所在loop的柔性增强,有利于该残基与底物结合。（5）探究了突变体D-4同野生型MTSase 3.6 L发酵罐产酶情况的差异,结果表明:37℃恒温培养至OD600达40时,调节温度至25℃,以0.1 g?L-1?h-1恒速流加乳糖进行诱导,诱导18 h,突变体D-4最高酶活为624.7 U?mL-1,而野生型MTSase为316.7 U?mL-1;同时,探究了两者以麦芽糊精作为底物制备海藻糖的差异,结果表明:加酶单位相同的情况下,两者的海藻糖转化率均为72.8%,结合3.6 L罐发酵情况,应用突变体D-4制备海藻糖,加酶体积仅为野生型的50%,成本更为低廉。