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利用毕赤酵母(pichiapastoris)表达外源蛋白时,常面临蛋白分泌和表达效果不理想的问题。其中一个重要的原因是外源蛋白过表达导致蛋白错误折叠,造成ER(endoplasmic reticulum)压力。对蛋白折叠功能进行改造可减轻ER负荷,促进外源蛋白的分泌表达。为了提高外源蛋白在P.pastoris中的分泌表达水平,本课题以yEGFP(Yeast Enhanced Green Fluorescent Protein)、Gal(β-galactosidase)和 CPC酰化酶(Cephalosporin C acylase)为模型蛋白,研究不同辅助折叠因子共表达对外源蛋白分泌表达的影响。利用P pastoris GS115的基因组注释信息,检索得到6个具有促进蛋白分泌表达潜力的内源性辅助折叠因子PDI1、PDI2、PDI3、BiP1、BiP2和HAC1,其中PDI2、PDI3和BiP2未见于其它报道。共表达辅助折叠因子对yEGFP重组菌的生长无明显影响。在Gal重组菌中,BiPl共表达使最大比生长速率降低了 27%,但共表达PDI1后最终菌浓增加了35%。CPC酰化酶重组菌的最大比生长速率在共表达BiP2后下降39%。与单独表达外源蛋白的出发菌相比,共表达6个辅助折叠因子均提高了 CPC酰化酶的表达水平,最高可提高60%(PDI2和BiP1),表达水平达到173.9 U/g DCW(PDI2);Gal表达水平均受到辅助折叠因子影响而下降,其中BiP2、PDI2和HAC1作用最显著,Gal表达水平降至出发菌株的0.3%、1.1%和0.7%;yEGFP的表达水平受到不同程度的影响,表达水平最高可提高近2倍(HAC1),PDI2、PDI3和BiP2则降低了 yEGFP的表达。从外源蛋白的分泌效果来看,yEGFP易于分泌,共表达辅助折叠因子对其分泌率没有显著影响;CPC酰化酶和Gal均难以分泌,BiP2和HAC1共表达可使CPC酰化酶的分泌率提高2倍以上,虽然除PDI2外的辅助折叠因子均促进了 Gal的分泌率,最高达到14.9倍(BiP2),但由于辅助折叠因子共表达降低了 Gal的表达水平,胞外Gal产量提高程度有限,最多为27%((BiP1)。各重组菌的基因转录和蛋白表达水平整体上存在较好的相关性,转录水平在一定程度上反映了蛋白表达水平。综合分析辅助折叠因子对3种外源蛋白表达、分泌,以及重组菌生长的影响,可以认为,在我们所考察的6个辅助折叠因子中,BiP1和HAC1促进外源蛋白分泌表达效果较好。