研究背景:　　肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)是一种神经系统慢性退行性、致死性疾病，主要导致脑和脊髓的上、下运动神经元进行性变性，临床表现为进行性的肌肉萎缩和瘫痪，并出现吞咽困难、呼吸衰竭，以至于死亡　　关于ALS的发病机制的学说主要包括遗传基因学说、兴奋性氨基酸学说、神经营养因子学说、自体免疫学说等。对ALS的治疗包括病因治疗、对症治疗和各种非药物治疗。利鲁唑是目前唯一认为有效的治疗该病的药物，但只能延缓疾病的进展三个月的时间，细胞移植是近年来治疗肌萎缩侧索硬化症的重要探索之一。ALS患者脑脊液中含有过量的氧自由基和过氧化物，在体外可以导致正常的神经元和星形胶质细胞出现毒性反应从而导致细胞死亡。因此尚不能明确HUCMSCs移植入这种病态的病理环境中，是否能存活及移植后有否治疗效果。为更贴近临床研究，我们采用人脐带间质细胞(HUCMSCs)经静脉移植SOD1-G93A转基因鼠，观察其发病时间、、生存时间、运动功能等，为HUCMSCs临床应用于ALS提供实验依据。　　目的:　　经尾静脉注射移植人脐带间充质细胞治疗SOD1-G93A转基因ALS大鼠，观察是否延长生存期，延缓发病时间以及行为学等的改善情况，探讨脐带间充质细胞对ALS治疗的可能机制，为间充质细胞的临床应用提供实验依据。　　方法:　　1.mSOD1 G93A转基因大鼠的鉴定　　实验用鼠的繁殖经过两次杂交，取子代鼠外周血提取DNA，PCR扩增SOD1-G93A基因，阳性者为SOD1-G93A转基因鼠。　　2.脐带间充质细胞的培养　　取健康新生儿脐带，转移到超净工作台中清洗干净，用剪刀剪成0.5-1.0mm3的大小，转入离心管内，制成细胞悬液后，将剪碎的组织碎块平铺于75cm2的培养瓶中，加入15％胎牛血清的DMEM-F12培养。　　3.脐带间充质细胞治疗　　经PCR鉴定为阳性的ALS成年大鼠行尾静脉注射，注射周期为3天，注射1个月后进行行为学评价。移植治疗组均以每只鼠1×106个/kg HUCMSCs细胞（溶入0.3毫升生理盐水）通过尾静脉输入;对照组通过尾静脉输入0.3 ml生理盐水，未治疗组不给予任何干预。每周观察、记录移植后移植鼠的一般状况、存活时间、发病情况及临床表现。　　4.临床行为学评价　　所有实验大鼠自90天起开始进行观察。观察指标为发病时间，生存时间，体重及行为学改善。如果大鼠持续两周出现运动功能障碍症状，回顾出现这种症状最早的时间即为临床发病时间。将实验大鼠的身体改为仰卧位后，30秒钟内不能恢复成俯卧位的时间定义为死亡时间。　　5.组织切片及神经元计数　　所有大鼠分别于干预后第5周和第7周进行组织化学分析。取材部位为L1-L3段脊髓，在所需时间点取出组织后经多聚甲醛后固定、沉糖、OCT包埋后，用冰冻切片冠状切片。我们利用尼氏染色观察神经元的细胞形态以及正常的神经元数目。　　6.免疫荧光组织化学　　干预后5周和7周取材的冰冻切片做ChAT免疫组织化学染色。用于免疫荧光染色的冰冻组织切片置于室温下先复温，然后用PBS冲洗3次，每次10min;然后滴加血清封闭40min，倾去血清，勿洗，擦干组织周围液体滴加一抗4摄氏度过夜。37摄氏度复温30min，滴加PBS冲洗3次，每次10min，擦干组织周围液体。滴加二抗(R488，1∶400)在室温下孵育45min。给细胞核染色，用1∶1000 Hoechst33342染细胞核1min。PBS冲洗后用水性封片剂封片固定，然后在荧光显微镜下观察染色结果。　　7.蛋白免疫印迹　　在所需时间点将实验大鼠处死后迅速取材，取出所需要检测的组织，然后将其匀浆提取目的蛋白，测定提取蛋白的浓度，上样电泳。电泳结束后将所需蛋白条带进行转膜，封闭杂交后，在暗室中曝光显影，用凝胶图像分析仪将获得的图片扫描，用Quantity One软件分析条带的光密度。　　结果:　　1.脐带间充质细胞鉴定　　将培养好的脐带间充质细胞进行免疫组化染色鉴定，确定为HUCMSCs后，进行移植。　　2.临床评估及行为学实验　　HUCMSCs移植组的ALS大鼠与未移植组和生理盐水组相比，具有显著性差异，HUCMSCs移植组在生存时间及病程中的作用显著，均优于各对照组。在发病后7-10天时（出生134-137天时），HUCMSCs移植组大鼠的体重及行为学实验的结果与各对照组之间均显示出显著性差异。　　3.运动神经元定性及定量　　腰段脊髓的前角神经元尼氏染色及神经元脊髓显示，与对照组大鼠相比较，实验组大鼠在发病后运动神经元出现大量死亡的现象，两者相比有显著性差异(p＜0.001)。接受HUCMSCs移植的SOD1-G93A转基因大鼠的运动神经元的死亡数量明显减少，与没有移植的以及对照组的相比较。ChAT的免疫组织化学的染色结果与尼氏染色的结果基本一致。　　4.蛋白免疫印迹　　HUCMSC细胞移植组的ChAT蛋白水平对照组大鼠相比明显降低，但比没有进行细胞治疗的SOD1-G93A组和生理盐水注射组高，并有显著性差异。而生理盐水注射组的ChAT蛋白水平和SOD1-G93A组无显著性差异(p＜0.01)。　　结论:　　脐带间充质细胞的治疗改善了转基因SOD1-G93A大鼠的运动功能，延长了其生存时间。其作用机制可能与HUCMSCs分泌神经保护因子，抑制运动神经元死亡有关。