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目的:1.建立灯盏细辛注射液中10个化学成分的HPLC含量测定方法,可为提高其质量控制标准及药品上市后再评价作参考;2.探讨灯盏细辛注射液通过调控ROS/RNS-MMPs-TJs信号通路对脑缺血致大鼠血脑屏障(BBB)损伤的保护作用,为临床合理用药提供依据。方法:1.在柱温30℃、流速0.91 mL·min-1、波长327nm、流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液的色谱条件下,使用高效液相色谱法测定灯盏细辛注射液中化学成分的含量。2.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型,应用下述指标评价灯盏细辛注射液及野黄芩苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸保护脑缺血致BBB损伤的有效性:①测定伊文思蓝透过BBB的透过率;②采用透射电镜观察大脑皮层中神经元及BBB超微结构;③TTC染色观察脑组织梗死情况;④神经功能评分;⑤HE染色观察脑组织海马区病理形态;⑥甲苯胺蓝尼氏染色检测尼氏小体表达情况。3.基于MCAO模型大鼠,采用以下2种方法研究灯盏细辛注射液调控ROS/RNS-MMPs-TJs信号通路的作用机制:RT-PCR法、WB法测定脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、金属蛋白酶-9(MMP-9)、闭合蛋白-5(claudin-5)、咬合蛋白(occludin)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的mRNA及蛋白表达。结果:1.灯盏细辛注射液中野黄零苷、灯盏甲素、咖啡酸、绿原酸、异绿原酸B、5-咖啡酰基奎宁酸、4-咖啡酰基奎宁酸、1,3-二咖啡酸酰奎宁酸、3,5-=咖啡酰基奎宁酸和4,5-二咖啡酰基奎宁酸10个化学成分的精密度、重复性、稳定性及加样回收率均符合要求,RSD值均小于3%,在其线性范围内峰面积与进样量的线性关系良好。2.灯盏细辛注射液、野黄芩苷及3,5-=咖啡酰奎宁酸能降低大鼠脑梗死比率,减轻大鼠神经行为学异常,减轻大鼠脑组织病变程度,增加尼氏小体细胞数目,修复损伤的大鼠神经元超微结构;此外,3个药物均能明显减轻BBB超微结构的损伤,降低伊文思蓝透过率。3.灯盏细辛注射液、野黄芩苷和3,5-二咖啡酰奎宁酸均能降低大鼠缺血侧脑组织中iNOS和MMP-9蛋白的表达,3,5-二咖啡酰奎宁酸还能升高claudin-5蛋白的表达。结论:1.建立了灯盏细辛注射液中10个化学成分的HPLC含量测定方法,该方法具有简便、准确、重现性好的特点,可用于灯盏细辛注射液的质量控制。2.灯盏细辛注射液、野黄芩苷及3,5-二咖啡酰奎宁酸对脑缺血致大鼠BBB及神经元损伤均有明显的治疗作用,主要的药效物质基础为野黄芩苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸等。3.灯盏细辛注射液及野黄芩苷通过抑制iNOS的合成,减少自由基对MMP-9的激活,保护了 BBB结构的完整性。3,5-二咖啡酰奎宁酸通过抑制iNOS的合成,减少自由基对MMP-9的激活,从而减少MMP-9对紧密连接(TJs)结构中重要细胞骨架连接蛋白claudin-5的降解,最终保护了 BBB结构的完整性。