目的早期研究显示在小鼠胰岛B细胞中有一种与P糖蛋白(也称为多药耐药蛋白1, Multidrug Resistantance Protein 1, MDR1)相似的65kDa大小的膜蛋白,且借助膜片钳技术发现此蛋白有类似磺脲类受体的功能,可促进胰岛素颗粒释放。本课题目的首先探测大鼠胰岛β细胞中mini-P糖蛋白存在的可能性,并使用拮抗剂及RNA干扰技术进行该蛋白的功能研究,分析其在胰岛素两相分泌中的作用。方法(1)经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离Wistar大鼠胰岛；INS-1细胞培养。分别提取大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中的总RNA,针对MDR1特异基因序列abcblb的3’末端及5’末端设计多对引物,进行RT-PCR;萃取大鼠胰岛及INS-1细胞蛋白,以MDR1特异性抗体(C219)进行免疫印迹实验厂探测目的蛋白的存在。(2)针对P糖蛋白特异基因序列(abcblb)设计寡核苷酸序列,使用siRNA干扰技术孵育胰岛；转染效率的观察分别采用荧光显微镜观察,real-time PCR法测定目的基因的表达量及Western Blot去测定蛋白表达量的变化；进行葡萄糖刺激的胰岛素释放实验,采用放免法测定RNA干扰后大鼠胰岛的胰岛素两相分泌的变化。(3)建立高糖培养大鼠胰岛凋亡的模型,采用real-time PCR法测定siRNA干扰后,凋亡基因表达的变化,评价RNA干扰对于胰岛凋亡的影响,进一步分析目的蛋白在胰岛素两相分泌中的作用。(4)使用MDR1特异性拮抗剂(环孢菌素A)干预大鼠胰岛,放免法测定胰岛素的两相分泌。结果(1)RT-PCR实验提取的大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中均扩增出了相应的目的片段,且在胰岛中的表达量较胰腺及INS-1细胞中表达量大。免疫印迹实验中,使用C219在胰岛匀浆蛋白中探测到65kDa大小的蛋白,在INS-1细胞蛋白萃取液中探测到了160kDa大小的蛋白。(2)在RNA干扰实验中,转染后48小时的胰岛于荧光显微镜下观察可见90%的胰岛均呈现红色荧光,提示转染成功；Western Blot实验结果提示在空白组、实验组及阴性对照组,使用C219均探测到了65kDa大小的蛋白,且实验组较空白组及阴性对照组蛋白表达量下调,而空白组及阴性对照无明显变化；siRNA干扰后abcblb基因的表达量实验组的较阴性及空白组减少,阴性组及空白组两组无变化；与abcblb基因相似的abcbla基因的表达量在三组中无变化,胰岛素合成相关基因insuin1、insulin2及胰高血糖素合成基因glucagon表达量无变化；siRNA干扰后,三组胰岛素分泌均呈现两相分泌,实验组的胰岛素一相及二相分泌较空白组及阴性对照组均受损。(3)高糖孵育后高糖组casp3及bax基因的表达量较正常组上调,高糖组Bcl-2基因的表达量较正常组下调,而Bcl-xl基因在两组中表达无差异；siRNA干扰后casp3 bax Bcl-2及Bcl-xl基因表达量在实验组、阴性对照组及空白组中的表达量均无变化。(4)在体外胰岛刺激实验中,MDR1拮抗剂环孢菌素A,抑制了胰岛素第二时相分泌,但胰岛素第一时相分泌无明显变化。结论(1)在INS-1细胞中有全长的P糖蛋白的表达,在大鼠胰岛中有mini-P糖蛋白的表达。P糖蛋白的表达不同,提示着二者可能具有不同的生物学功能。在INS-1细胞中,P糖蛋白可能主要与耐药相关,而在胰岛细胞中,mini的P糖蛋白可能主要与胰岛素的分泌释放相关。(2)siRNA干扰后,目的基因abcb16表达量下调,胰岛素的两相分泌均受损,而凋亡相关基因及胰岛素合成相关基因的表达无改变,提示siRNA干扰后未直接影响胰岛素的合成,且胰岛素的两相分泌受损并非通过凋亡途径,进一步支持了前述观点,P糖蛋白或mini-P糖蛋白影响胰岛素颗粒的酸化成熟,调节胰岛素的两相分泌。(3)使用环孢菌素A干预胰岛后,胰岛素的一相分泌未受影响,而胰岛素的二相分泌明显受抑制,推测其拮抗P糖蛋白或mini-P糖蛋白,从而影响胰岛素颗粒的酸化成熟,表现为胰岛素的二相分泌受损。(4)深入研究mini-P糖蛋白的结构及功能,可为新的降糖药物的研发提供理论基础,为糖尿病的治疗提供新思路。