论文部分内容阅读
目的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)病自发现以来一直是危害犬类健康的最严重的传染病之一,尤其对2~6月龄的幼犬危害最大,临床上多表现为吐逆、拉稀及出血性肠炎为主。随着病毒的不断变异,给此病的治疗以及预防带来了新的挑战。本研究以在2015年9月~2016年9月间,贵阳某动物医院收治的患犬细小病毒病病犬为研究对象,通过对患病犬的临床诊断与治疗,总结出目前贵阳地区治疗犬细小病毒病的最佳方式,以提高治愈率。对病毒进行分离鉴定、序列分析及其原核表达,为探究病毒的变异情况,了解贵阳市流行基因型以及对未来新疫苗的研发提供一定数据。方法根据宠物医院门诊收治的病犬,首先对病犬进行临床初诊,在进行胶体金试纸的确诊,畜主对治疗方法的要求,对患犬细小病毒病的病犬进行不同方式治疗,分为对症支持治疗组、特异性治疗组以及综合治疗组。对每组治疗的病犬进行用药分析,对比三种不同治疗方法,总结出对犬细小病毒病的治疗的最佳用药方法。随机择取患病犬20只,搜集粪便拭子,采取同步接种法,将经过处理的病料上清液接种F81细胞,进行病毒的分离培养;对成功分离的病毒进行血凝及血凝抑制试验进行初步鉴定,再对所分离的病毒进行病毒的PCR鉴定,根据GenBank上传的犬细小病毒全基因组序列,设计两对特异性引物,分别扩增VP1基因与VP2基因;对扩增的VP1与VP2基因进行TA克隆并测序,对测序结果进行分析。分别将VP1与VP2基因亚克隆到pET-32a载体上,进行原核表达载体的构建,构建成功后转化BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导表达,对诱导表达进行温度与浓度的优化,得到VP1与VP2蛋白的最优表达条件。对诱导的VP1与VP2蛋白进行Western Blot试验,验证VP1与VP2蛋白的免疫原性。结果1.通过临床症状对43只患病犬进行初诊,再进行胶体金试纸确诊37只,准确率达到86%;本试验对37只患犬细小病毒的病犬根据其畜主要求而分为用三种不同治疗方法,其中对症支持治疗组治愈率最低,为14.3%,治愈率最高的为综合治疗组,为84.6%,特异性治疗组次之,为50%。2.对接种F81细胞的20只病犬病料,成功分离出10株犬细小病毒,这10株分离株均能使F81细胞产生変圆、聚集、脱落等细胞病变;对10株分离的病毒进行血凝及血凝抑制试验,血凝试验病毒效价均在1∶25以上,血凝抑制试验表明,犬细小病毒单克隆抗体能很好的中和分离的病毒;对10株分离株进行PCR鉴定,均能在预期目的条带位置出现明显条带。3.对10株分离株的VP1与VP2基因进行序列分析,所分离的VP1基因与国内外16株参考株的核苷酸同源性在98.6%~100%,且亲缘关系与国内分离株较近,与国外分离株较远。对VP2基因分析,此次分离的10株分离株中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型;VP2基因与国内外30株参考株核苷酸同源性在97.7%~99.9%,亲缘关系与国内分离株较近,与国外分离株较远,且10株分离株与疫苗株亲缘关系较远。4.对VP1与VP2蛋白进行诱导表达,VP1蛋白在37℃,IPTG浓度大于1 mM时,获得最佳表达量;VP2蛋白在37℃,IPTG浓度为2 mM时获得最佳表达量。用His标签通过Western Blot均能检测到所表达的VP1与VP2蛋白。