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在微生物的次级代谢中,可利用聚酮合成酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成结构多样的聚酮化合物以及多肽产物。本文通过核磁共振技术解析了了酰基载体蛋白Fr9M的溶液结构,并进行了动力学表征。Fr9M参与了Fr901464的支链的合成。同一体系中另有15个ACP参与了聚酮骨架链的延伸。Fr9M的活性位点序列为‘NSV’,这不同于其他ACP的保守序列‘DSL’。我们旨在结构解析,研究序列-结构-功能的联系。
本文利用NMR技术解析了apo-型与holo-型Fr9M的结构。首先分别制备了13C、15N双标记的apo-Fr9M、holo-Fr9M蛋白样品。然后采集了一系列的二维和三维核磁共振实验。利用NMRPipe对NMR图谱进行处理,利用Sparky软件对NMR信号进行归属,利用CALIBA软件将NOE强度转化为距离约束。利用TALOS程序获得骨架二面角约束。利用Xplor-NIH程序计算获得最终的三维溶液结构。从100个精修结构中挑选20个结构。相对于平均结构,对于apo-Fr9M来说,20个最优构象骨架原子RMSD值为0.62±0.11(A),重原子为1.03±0.11(A);而对于holo-Fr9M来说,20个最优构象原子RMSD值为0.57±0.12(A),重原子为1.45±0.24(A)。结构分析,apo-与holo-构象整体结构RMSD值为2.835,位于活性位点附近的残基构象具有较明显变化,α3,α4helices的取向也有明显不同,这种变化可能有利于Ppant的摆动。进一步分析发现,holo-Fr9M的疏水表面更大一些,可能有利于Ppant连接了底物小分子之后,能避免底物分子被水解;Ppant与蛋白疏水区域的作用有利于Ppant的摆动,从而实现底物的运输。动力学性质的研究表明整个蛋白均处于比较刚性的状态。holo-Fr9M loop区以及泛酰巯基乙胺辅臂区域,杂核NOE值较低,说明柔性较高,利用小分子底物的运输。