目的 基质金属蛋白酶(MMPs)在动脉粥样硬化，冠状动脉成形术后和冠状动脉搭桥术后再狭窄以及动脉粥样硬化斑块破裂过程中起着十分重要的作用。因此，抑制MMPs的生成及其酶活性在抗动脉粥样硬化和增加斑块稳定性的治疗过程中有着十分重要的意义。已往人们曾采用多种方法抑制MMPs，但均未获得好效果。他汀类药物自七十年代问世以来一直是世界上应用最广泛的降血脂药物，临床试验提示他汀类药物有着降低血脂以外的改善斑块生物学特性的作用。最近的研究发现他汀类药物抑制人内皮细胞分泌MMP-1，明显抑制鼠巨噬细胞中MMP-9的分泌和活性。如果他汀类药物能抑制斑块部位其它种类的细胞分泌多种MMPs，那么该类药物在稳定斑块的过程中发挥更重要的作用。因此我们研究他汀类药物是否影响兔和人的血管平滑肌细胞、兔的泡沫细胞分泌MMP-1，-2，-3和-9，进而更全面深入地揭示他汀类药物抗动脉粥样硬化发生发展和增加斑块稳定性的机制，为临床治疗提供依据。 方法 1．细胞培养：将兔主动脉或人大隐静脉段切成碎片，用含15％胎牛血清的DMEM培养基培养。当平滑肌细胞长满培养瓶底面时，用胰蛋白酶悬浮细胞进行传代培养。将1-3代的传代细胞以2×10~5／孔的密度置于6-孔的培养盘中，准备做western blot或zymography实验，或以1×10°／培养瓶的密度置于75cm~2的培养瓶中，准备做RT-PCR或EMSA实验。对所有的试验，当细胞长至80％满时，换用无血清培养基培养3天，更换无血清培养基，并加入适当浓度的待观察物质，孵育适当时间。 兔泡沫细胞来源于高胆固醇饮食饲养的新西兰白兔的皮下颗粒瘤，如参考文献所述。将细胞以5×10~5细胞／孔的密度置于24-孔培养盘中，45分钟后弃去未粘附于盘底面的细胞，向培养盘中加入新鲜的不含血清的但含有适当浓度待观察物质的巨噬细胞培养基培养48小时。 2．western blot分析：经8％聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，封闭，加 1抗，辣根过氧化物酶标记沪抗，化学发光试剂增强反应J线片压片曝光，经光密度仪扫描分析，计算MMP一二和MMP－3蛋白表达相对量。 3．ZymograPhy分析：经含有 Zmg／ml gelatin的 7．5％聚丙烯酸胺变性凝胶分高蛋白，将凝胶置于反应液中 37℃过夜，用 0．2％Coomassie BillianBlue染色2－3 ／J’时，脱色，用 GS 690 Image An吻sts so一 system进行MMP－2和MMP－9定量分析。 4．Co岭n吻tie，p－casein吻tie 和gel颓nowc活性分析：按照使用说明，分另使用 Type Coil昭enase Ass的 Kit，8romdysln act。fly Ass的 it，Type Collag6nase Asssy it进行相应的酶活性分析。 5．电泳迁移率变动分析任MSA）：将h－’中 ATP标记至APJ或NF－KB寡聚核甘酸5”端。提取兔血管平滑肌细胞核蛋白并定量。标记的寡聚核甘酸与核蛋白进行结合反应，6％聚丙烯酸胺变性凝胶分离反应液，将凝胶取出干燥J线片压片曝线，放射自显影，光密度仪扫描分析。 6．RT－PCR反应：从2 X 10‘兔血管平滑肌细胞中提取总 RNA，逆转录，PCR过程如下：94℃，二分钟；55 T，且分钟；72 t，卫分钟。MMP一＼－3，－9和TIMP－l循环33次，GAPDH循环22次，TIMP－2循环25次。 7．统计学方法：所有实验最少重复3次，统计学处理采用microsoft ex－cel软件进行 t检验，P＜0．05为差异有显著性，P＜0．01为差异非常显著。 结 果 l．洛伐他汀对血管平滑肌细胞MMP－l，－2，－3，－9和TIMP－l，－2的影响。 洛伐他汀抑制兔VSMCS MMP一八一2，－3，－9的分泌且呈剂量一效应依赖性关系。洛伐他汀对TIMP一二和TIMP—2的表达均无明显影响。在对照组＊LJ PDGFm刺激组和洛伐他汀组的细胞培养基中均检测不到 MMPS酶活性。 洛伐他汀也抑制人VSMCS MMP－1，一人一3，－9的分泌。 洛伐他订抑制 IL则 和 PDGF。。对兔 VSMCs的刺激作用，使 AP一和NF一咄结合活性明显降低。洛伐他汀对免VSMCs的MMPs mRNA水平无明显影响。IL则 和 PDGF＊以及洛伐他汀对 TIMP－l，TIMP－2和 GAP ·2·DH的mRNA水平均无明显影响。 2．洛伐他订对兔泡沫细胞MMP－l，－3，－9的影响。。 洛伐他汀抑制兔泡沫细胞分泌MMP叫，－3和一9，切呈剂量一效应依赖性关系。在无外来刺激的作用下，兔泡沫细胞的培养基中含有分解底物I型胶原蛋白、p－casein和凝胶蛋白的酶活性，分别与MMP－＊－3和一9酶活性相对应，洛伐他汀明显抑制分解相应底物的酶活性。 3．异戊H烯类物质对洛伐他汀作用的影响 在兔VSMCs中，Mevalonate或GGPP能够完全逆转洛伐他汀对MMP－＊－3分泌的抑制作用，部分逆转洛伐他汀对MMP一入一9分泌的抑制作用，而sopalene对洛伐他订抑制作用无明显影响。 在免泡沫细胞中，squalene只能轻度逆转洛伐他汀对MMP一二的抑制作用，但对MMP－3和一9无影响。mevalonate完全逆转洛伐他订对MMP－1和MMP－9抑制作用，92。2％