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土壤盐渍化是抑制植物生长、降低作物产量的主要因子之一。盐对于植物的毒害作用主要是由于水分亏缺导致的渗透胁迫以及过量的Na+对重要生化过程的毒害。植物克服盐胁迫的主要机制是Na+的外排和液泡区室化。质膜Na+/H+反向转运蛋白利用质膜ATPase产生的跨膜质子梯度将Na+排出细胞,减少Na+向叶片中的长距离转运而保护光合组织免受盐的毒害。液泡膜Na+/H+反向转运蛋白则利用液泡膜质子泵(H+-ATPase和H+-PPase)产生的跨膜质子梯度将Na+区室化进入液泡,不仅减轻了过多Na+的累积对细胞质的毒害,而且可以利用NaCl作为溶质维持渗透势以驱动水分进入细胞。因此,膜定位的Na+/H+反向转运蛋白和质子泵在植物耐盐中发挥着重要作用。已有诸多研究表明,通过基因工程手段提高该类蛋白的表达量是提高植物耐盐性的有效途径之一。
本研究首先从大豆(Glycine max L)中克隆到了液泡膜Na+/H+反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA。该cDNA序列包括5’端非翻译区464bp,编码区1641bp,3’端非翻译区486bp,共2591bp。推断其编码的蛋白共546个氨基酸,具有典型的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白特征,与已知功能的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白AtNHX1、OsNHX1、AgNHX1具有较高的同源性,分别达75.8%、75.3%、78%。GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因,其表达具有组织特异性,并能受到NaCl、KCl、LiCl、ABA以及脱水胁迫的上调;此外,其在不同组织中的表达差异还与品种的耐盐性有关,耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于,而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种。这些结果暗示着本研究中克隆的大豆GmNHX1基因与大豆的耐盐性相关。
在建立和优化了两种优质豆科牧草--百脉根和紫花苜蓿遗传转化体系的基础上,通过根癌农杆菌介导的方法成功地进行了拟南芥AVP1基因、大豆GmNHX1基因的过表达研究,不仅获得了耐盐性提高的T1代过表达AVP1的转基因百脉根株系,也进一步证明了大豆GmNHX1在耐盐性中的作用。而且,对过表达AVP1及过表达GmNHX1的百脉根进行Na+、K+含量测定发现,与预期相反,两种转基因株系与对照相比,在盐胁迫条件下均具有较低的Na+含量和较高的K+/Na+比率,显示了百脉根中过表达拟南芥AVP1及大豆GmNHX1所导致的耐盐性提高与减少转基因植物中Na+的积累有密切关系。GmNHX1在紫花苜蓿中过表达,也有效提高了转基因植株的耐盐性。
耐盐性提高的转基因豆科牧草的获得,不仅为牧草的抗盐育种和沿海滩涂盐碱地的开发、利用及绿化提供了基础材料,同时也为我们进一步了解豆类植物中这些耐盐相关基因的作用机制奠定了基础。