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目的研究表明,全球卵巢癌的发病率在女性癌症患者中占第七位,是世界上第八大导致女性癌症患者死亡的原因。目前,越来越多的医学报道和研究表明,中草药已被广泛用于治疗多发性卵巢癌,并具有良好的临床疗效。然而,中草药成分繁杂,潜在靶点也尚不清楚,同时中药对治疗卵巢癌的潜在分子靶点机制复杂,有待进一步阐明。在本回顾性研究中,我们基于临床资料和网络药理学,探讨了中草药治疗卵巢癌的潜在分子靶点。首先我们收集临床资料,统计分析出对治疗卵巢癌生存期最相关的中草药。而后采用网络药理学方法,对中药治疗卵巢癌的有效成分进行分析,并根据分子结构预测中草药治疗卵巢癌的潜在分子靶点,总结中药治疗的主要作用机制,通过分子靶点网络构建及分析,为每一种中药发挥抗癌作用提供依据,借此在以后用于临床用药筛选。最后根据网络药理学的分析结果,通过实验验证中药治疗卵巢癌的作用机制。方法1.病例收集:在研究中收集整理了202例从2005年11月至2013年6月间在天津市肿瘤医院确诊为卵巢癌病例进行回顾性分析,根据是否在治疗过程中使用中药,将患者分为中药组和非中药组,随后通过电话咨询的方式随访了患者的治疗和生存发展现状。2.生存分析:Kaplan-Meier法和Cox回归分析这两种统计学方法,在本研究中被用来对202例卵巢癌患者的生存情况进行了针对性的统计分析,统计并比较了中药组和非中药组患者的中位生存期,以及第1、2、3、5、7、10年生存率是否有统计学差异,采用双变量相关分析中草药与生存时间的相关性,并判断中药是否是独立保护性预后因素。3.网络药理学分析:记录并计数收集到的中药组患者使用过的中药处方,记录各味中药的使用频次,采用双变量相关分析结合相关数据分析的方法筛选出与生存期息息相关的中药。通过搜索TCMSP数据库和Batman数据库,以查找并筛选中药的有效成分和成分作用的靶点,进行归类统计。使用CTD数据库和TTD数据库查找与卵巢癌相关的分子靶点。将查找到的中药有效成分作用靶点和乳腺腺癌相关靶点进行分子对接,在Cytoscape软件中绘制出相应的分子靶点网络图,并将对接后的靶点进行富集和分析,找出经典的信号通路,对靶点进行归类和总结。4.实验验证:卵巢癌细胞系SK-O-V3细胞用于进行实验验证,对筛选中药的水提物进行抗癌作用检测。采用台盼蓝细胞计数,CCK-8试剂盒和Transwell实验来评价中药对卵巢癌细胞的增殖和迁移能力的影响,通过Western blotting实验来验证网络药理学所预测的靶点。结果1.生存分析结果(1)在研究中收集整理了202例从2005年11月至2013年6月间在天津市肿瘤医院确诊为卵巢癌病例,其中中药组87例病例,非中药组115例病例。(2)生存分析结果显示,中药组病人和非中药组病人的中位生存期分别是68个月和62个月,FIGOⅢ期患者中位生存期分别为91个月和52个月,FIOGⅣ期患者中位生存期中位生存期分别为60个月和22个月,两组2、3、5、7、10年生存率为96.6%,89.7%,70.1%,27.6%,4.5%和80.9%,67.8%,54.8%,2.6%,0(P<0.001).(3)Cox回归分析模型表明,使用中药,对于卵巢癌患者的生存效益来说,是一个独立的保护性因素(95%CI:0.272-0.633,P<0.001)2.网络药理学分析结果(1)双变量相关分析结果表明有12味中药与生存期最相关,12味中药分别是:附子、杜仲、蛤蚧,益母草、生姜、马鞭草、王不留行、桑寄生、商陆、三七、桂枝、牡丹皮(P<0.025)。(2)通过TCMSP数据库和Batman数据库查找筛选中药的有效成分和成分作用的靶点,通过CTD数据库和TTD数据库查找与卵巢癌相关的分子靶点。最终通过筛选药物成分靶点和卵巢癌靶点对接得到208个对应靶点。VDR,BCL-2,NF-κB,TP53,IL-10,FAS,BAX,EPO为对接后预测的中药治疗卵巢癌可能的靶点。(3)将对接后的靶点通过KEGG富集分析后,发现以上靶点参与到凋亡通路,p53信号通路和NF-κB信号通路,Fox O通路,PI3K-AKT通路等明星通路相关。4.实验验证结果(1)12种药物水提物对SK-O-V3细胞增殖的影响:分别采用浓度为25μg/ml、50μg/ml,100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml的中药水提物作用于SKO-V3细胞1-5天后,台盼蓝染色,药物浓度为100μg/ml时,细胞数目明显减低,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。分别采用浓度为100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml的中药水提物作用于SKO-V3细胞1-5天后,CCK-8实验显示药物浓度为100μg/ml时,细胞数目明显减低,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)(2)12种药物水提物对SK-O-V3细胞迁移能力的影响:不同浓度的药物水提物(100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml)作用于SK-O-V3细胞,16小时后计数Transwell小室底面细胞数量,药物浓度为100μg/ml时,细胞数目明显减低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。(3)中药抗卵巢癌机制的验证:通过Western blotting实验发现,使用药物水提物后,SK-O-V3细胞中BCL-2和NF-κB表达降低,VDR和TP53表达量升高。结论:1.临床数据显示,中药治疗卵巢癌能明显提高患者的生存期,尤其是晚期卵巢癌患者的生存期,是独立的保护性预后因素。2网络药理学分析表明,12种中药的抗卵巢癌机制可能主要通过1)抑制BCL-2和NF-κB活性来抑制增殖;2)通过增加TP53和VDR的表达来抑制肿瘤生长;3)通过直接抑制NF-κB抑制NF-κB信号通路的传导;4)通过多靶点促进细胞凋亡;5)减少IL-10引起的免疫逃逸。3.实验验证结果表明,12种中药的水提物能够抑制卵巢癌细胞的增殖,抑制迁移等方面发挥抗肿瘤的作用,基本吻合以上网络药理学的预测。