论文部分内容阅读
日本乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种重要的人兽共患病，主要在亚洲流行，它能导致人产生严重的神经系统疾病甚至死亡；另外，该病还可以引起多种动物的感染和发病，严重影响养殖效益。
RNA复制子的构建是将RNA病毒基因组中的结构基因删除，而保留其非结构基因及基因组的5UTR和3UTR的顺式作用元件，将其转染细胞后能够在细胞质中大量复制并高水平表达病毒的非结构蛋白和外源蛋白。近些年来，昆津病毒、蜱传脑炎病毒和黄热病病毒复制子载体系统的研究日益深入，在研制疫苗和基因治疗方面得到了广泛的应用。本研究拟构建JEV复制子载体系统，建立疫苗研究的新平台。
本研究利用RT-PCR和融合PCR的方法，以改造过的低拷贝质粒pOKM为骨架，在缺失JEV基因组结构基因（第165-2402核苷酸）的基础上，构建包括CMV启动子、5UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸、E蛋白C端的25个氨基酸、所有非结构蛋白、3UTR、核酶(RDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV复制子载体系统(pJEV-REP)。为了验证所建立的JEV复制子的功能，构建了含有报告基因EGFP的JEV复制子载体pJEV-REP-GFP-IRES与pJEV-REP-GFP质粒，转染BHK-21细胞和293T细胞，24h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光，表明JEV复制子载体能表达外源基因；RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)的结果表明该载体能在宿主细胞中实现自我复制。
本研究还通过RT-PCR和融合PCR的方法，扩增出高致病性猪蓝耳病病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP PRRSV)GP5和M基因并插入到pJEV-REP中，从而构建了共表达PRRSV GP5和M蛋白的pJEV-REP重组质粒（pJEV-REP-G-2A-M和pJEV-REP-G-2A-M-IRES）和真核表达的重组质粒(pCAGGS-GM)。Western-blot实验表明GP5与M蛋白能在293T细胞中得到正确表达，并以异源二聚体的形式存在。然后将共表达GP5和M蛋白三组重组质粒、载体质粒pJEV-REP-IRES分别免疫8周龄小鼠，每只l00ug，共免疫三次，每次免疫相隔3周，同时设立PBS对照组。间接ELISA的结果表明，pJEV-REP-G-2A-M和pJEV-REP-G-2A-M-IRES复制子疫苗组均能产生特异性抗体，并且高于DNA疫苗组pCAGGS-GM，展现出良好的体液免疫应答能力；另外，WST-8法淋巴细胞增殖实验结果表明复制子疫苗组比DNA疫苗组免疫的小鼠能够产生更强的淋巴细胞增殖效应，展示了更好的诱发细胞免疫应答能力。