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研究背景 汉坦病毒在全世界广泛流行,其主要通过啮齿类动物传播,感染人体可引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)两种急性传染病。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家。正汉坦病毒属的汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)是我国重症HFRS的主要病原体。HTNV为单负链RNA病毒(-ss RNA),其基因组按大小分为L、M和S三个片段,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)、包膜糖蛋白前体(glycoprotein prescursor,GPC)以及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。目前临床上对于HFRS尚无特异性治疗药物,主要原因是HTNV致病机理尚不清楚。故深入研究HTNV感染、复制过程可为HFRS发病机制提供理论基础,为新型抗HTNV治疗药物提供潜在靶点。病毒-宿主相互作用是近年来HTNV感染、复制研究领域的热点问题。HTNV NP是病毒感染过程中在宿主胞质内表达量最多的病毒蛋白,已知其可结合病毒核酸起到保护病毒基因组的作用,但尚不清楚NP可与哪些宿主蛋白相互作用,其分子机制及生物学意义是什么。探索HNTV NP与宿主蛋白相互作用的过程将为阐明HTNV感染、复制机理提供理论基础。研究目的 鉴定与HTNV NP相互作用的宿主蛋白,明确筛选出的宿主蛋白DDX17在HTNV感染、复制过程中的作用。方法与结果1.筛选并鉴定与HTNV NP相互作用的宿主蛋白1.1构建含有HTNV NP融合亲和素标签(SF-NP)的真核表达质粒首先,设计针对HTNV(76-118株)S片段全长基因的PCR引物,在引物上下游分别加入Eco RⅠ和KpnⅠ酶切位点,以HTNV S片段的c DNA序列为模板进行PCR扩增,测序鉴定正确后获得含有双酶切位点的S片段的c DNA。同时,将亲和素标签基因(SF)连接进入真核表达载体p CAGGS,测序鉴定正确后获得p CAGGS-SF。然后,将含有双酶切位点的S片段的c DNA连接进入p CAGGS-SF,测序鉴定正确后获得含有NP融合亲和素标签(SF-NP)的真核表达质粒p CAGGS-SF-NP。最后,将p CAGGS-SF-NP转染HEK-293T细胞,通过Western blot验证目的基因表达情况,结果可见SF-NP表达条带大小与预期相符,表明成功构建含SF-NP的真核表达质粒。1.2亲和层析分离鉴定与NP相互作用的宿主蛋白将p CAGGS-SF-NP及对照质粒p CAGGS-SF分别转染HEK-293T细胞,转染48h后裂解细胞,将细胞裂解液在层析柱中与Strep Trap?HP琼脂珠孵育,经过缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱等步骤后获得与SF-NP相互作用的宿主蛋白,进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色。与p CAGGS-SF转染组相比,p CAGGS-SF-NP转染组在75-60 k Da、35-25 k Da之间可见特异性条带;通过切胶收获上述特异性条带,分别编码为1号、2号和3号,交由华大基因公司进行质谱鉴定。结果显示,在1号胶条中发现评分较高的解旋酶家族成员DDX3、DDX17和DDX5等。结合既往文献报道及本课题组前期研究结果,选取DDX17作为研究对象进行后续实验研究。2.明确DDX17分子在HTNV复制过程中的作用2.1明确HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子表达水平及亚细胞定位的变化(1)HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子表达的变化在MOI=1的条件下将HTNV感染人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),同时以未感染组为对照,分别在0 h、12 h、24 h、3 d和5d收获细胞样品,裂解后提取RNA并反转录制备c DNA,采用实时定量PCR(q RT-PCR)检测HTNV感染后各个时间点DDX17 m RNA的表达情况。结果显示,HTNV感染后DDX17 m RNA的表达水平逐渐升高,在24 h时达到最高,随后开始降低,在感染后72 h表达量已恢复到正常水平,提示DDX17可能在HTNV感染早期发挥作用。(2)HTNV感染后宿主细胞中DDX17分子亚细胞定位的变化HTNV感染HUVEC(MOI=1),在感染后24 h通过免疫荧光技术检测DDX17亚细胞定位的变化,结果提示未感染组DDX17主要定位于细胞核,而HTNV感染组DDX17在细胞质中的含量增加。2.2明确过表达DDX17分子对HTNV复制的影响构建并包装含有p LVX-Zs Green-DDX17的重组慢病毒,检测慢病毒滴度并验证过表达效果;之后,用慢病毒感染HUVEC,以含有空载体p LVX-Zs Green的慢病毒感染组为对照,在慢病毒感染48 h后,感染HTNV(MOI=1),分别在HTNV感染后24 h、48 h和72 h收获细胞样本,并利用q RT-PCR、Western blot和In-cell western等方法分别检测样本中HTNV核酸表达水平、蛋白表达水平及子代病毒滴度,结果显示,与对照组相比,过表达DDX17后,细胞中HTNV S片段的复制水平、NP的表达水及子代病毒滴度均显著增加,提示DDX17对于HTNV复制具有促进作用。2.3明确HTNV NP与DDX17相互作用情况根据Uniprot所示NP(C0IXS4)及DDX17(Q92841)蛋白序列及结构域,分别构建含有标签的NP/DDX17全长及截短体质粒,即Myc-NP/NP截短体,HA-DDX17/DDX17截短体,之后进行如下实验:(1)将Myc-NP与HA-DDX17/DDX17截短体共转入HEK-293T细胞,在转染48 h后收集细胞裂解液进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)实验(NP pull down DDX17/DDX17截短体),即以抗Myc标签的抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),以抗HA标签的抗体进行免疫印迹(immunoblotting,IB),明确NP是否与DDX17相互作用及参与相互作用的DDX17结构域,结果提示NP可以将DDX17 pull down,其中DDX17的aa314-652区域(DDX17-F3R4)是其与NP相互作用的关键区域;(2)反之,将HA-DDX17与Myc-NP/NP截短体共转入HEK-293T细胞,在转染48h后收集细胞裂解液进行co-IP实验(DDX17 pull down NP/NP截短体),即以抗HA标签的抗体进行IP,以抗Myc标签的抗体进行IB,明确DDX17是否与NP相互作用及参与相互作用的NP结构域,结果提示DDX17可以将NP pull down,其NP的aa121-429区域是其与DDX17相互作用的关键位点。既往文献报道,DDX17的aa314-652区域包含解旋酶结构域,提示DDX17可能辅助HTNV基因组解螺旋过程;而NP的aa121-429区域包含两个RNA结合结构域,即RNA结合结构域aa121-300,可特异性结合病毒RNA;非特异RNA结合结构域aa301-429,可结合任意RNA,可能在截获宿主m RNA“帽子”过程中发挥作用;而co-IP实验结果显示,DDX17可分别与上述两个结构域相互作用,提示DDX17可能在病毒基因组解旋及病毒获取宿主m RNA“帽子”过程中发挥作用。2.4初步探索HTNV感染后DDX17分子细胞亚定位改变的机制将含有Myc-NP和HA-DDX17的质粒分别转染HEK-293T细胞,以抗Myc/HA标签抗体进行IP,用抗核转运分子KPNA1、2、4、5、6的抗体进行IB,结果显示,NP、DDX17均可以与KPNA1、2结合,提示NP可能通过竞争性结合KPNA1、2,使DDX17分子滞留于细胞质,以利于自身的复制。结论1.通过亲和层析联合质谱鉴定筛选出包括DDX17在内的多个与NP相互作用的宿主蛋白分子。2.DDX17可以促进HTNV的复制,并与NP共定位于细胞质。3.DDX17的解旋酶结构域与NP的RNA结合结构域和非特异RNA结合结构域作用,提示DDX17可能通过协助病毒基因组解旋、获取宿主m RNA“帽子”结构等过程促进病毒的复制。4.DDX17与NP可能通过竞争性结合核转运分子KPNA1、2致使DDX17滞留于细胞质,从而促进HTNV的复制。