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壳寡糖是由2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的碱性氨基寡糖,具有水溶性好、易吸收等特点可以作为保鲜剂、抗氧化剂及植物生长调节因子等应用于食品、农业等多个行业。壳寡糖成品的价格很高,其制备大部分来自甲壳质的化学降解,在此过程中带来了严重的污染,极大地限制了壳寡糖的大规模化生产,因此如何安全、快速、大量的获得壳寡糖成为本研究的重点。 利用重组大肠杆菌合成壳寡糖是近年来一种新型的技术,本实验以中华苜蓿根瘤菌(S.meliloti)的nodB基因为模板,将其连接到pET-28a载体上,构建两种不同融合方式的重组质粒pET-nodB1和pET-nodB2,其中nodB1基因是插入到BamHⅠ和XhoⅠ,N端带有T7-tag,C端带有His-tag;nodB2基因是插入到NcoⅠ和XhoⅠ,仅在C端带有His-tag,将它们转化入大肠杆菌BL21,诱导表达分离纯化两种重组蛋白NodB1和NodB2,其分子量分别为30KD和26KD。 再以茎瘤固氮根瘤菌(A.Caulinodans)的nodBC基因为模板化学合成片段长度为1879bp的基因,其中nodC基因编码的NodC蛋白(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶)可以将糖基供体(UDP-GlcNAc)转移到糖基受体上,合成由2～6个糖基组成的N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体;nodB基因编码几丁寡糖脱乙酰酶,即NodB蛋白,它可以作用于含有2～6个N-乙酰氨基葡萄糖的寡聚体,脱去其非还原端的一个乙酰基。将合成的nodBC基因连接到pUC18的Lac启动子下游,构建重组质粒pUC-nodBC,转到大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒,分别用EcoRⅠ和EcoRⅠ、BamHⅠ对重组质粒进行单酶切和双酶切,并进行测序,表明合成的基因正确。利用产糖培养基MMY,通过IPTG诱导表达重组大肠杆菌,确定外源基因能够编码相应的蛋白来产生壳寡糖。然后利用优化的MMYNG培养基在10L的发酵罐中培养重组大肠杆菌,离心收集284.68g菌体,利用反复冻融法对细胞进行破壁处理,并加入一定量的浓盐酸来沉淀蛋白,离心收集上清通过活性碳吸附,采用40％的乙醇将目的产物洗脱下来,对洗脱液浓缩,取浓缩后的样品过P4凝胶分子层析柱对目的产物进一步的分离纯化。收集相应的样品通过TLC实验检测,最后利用质谱分析确定产物的结构,本实验一共得到3种主要寡糖,然后通过ESI-MS测定各组分的分子量:830(几丁四糖)、1033(几丁五糖)和991(壳五糖)。