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第一部分雷帕霉素联合活性氧响应清除水凝胶调节巨噬细胞M2型极化治疗大鼠椎间盘退变研究目的椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration,IVDD）与炎症反应密切相关。机械负荷等危险因素诱发的IVDD通常伴随免疫微环境异常,主要包括炎症细胞浸润及炎症因子升高,椎间盘免疫微环境的失衡会导致髓核细胞变性、细胞外基质降解,加剧IVDD。巨噬细胞作为退变椎间盘组织中浸润及炎症因子产生的主要细胞,能够分化为促进炎症的M1型和抑制炎症、促进组织修复的M2型。退变椎间盘炎症微环境的特征在于M1/M2的失衡和高水平的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）。调节巨噬细胞M2型极化及降低组织活性氧水平能够改善椎间盘免疫微环境,促进组织修复;以此为目标,在本部分中,我们制备了载有雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）的ROS响应清除水凝胶（Rapa@Gel）,该体系不仅能响应ROS发生降解,还能有效降低ROS水平,缓释的Rapa能够促进巨噬细胞M2型极化。Rapa@Gel有效改善退变椎间盘局部炎症微环境,促进组织修复,延缓椎间盘退变。该研究可能为椎间盘退变提供新的治疗策略。研究方法扫描电镜,流变仪,高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）,小动物成像仪等检测手段对载有雷帕霉素的ROS响应清除水凝胶（Rapa@Gel）进行物理表征及雷帕霉素缓释能力检测。使用光声及硫酸钛在体内和体外检测Rapa@Gel对ROS的响应及清除能力。组织学切片检测Rapa@Gel的生物相容性。在体外实验,我们用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和H2O2模拟炎症环境,流式细胞仪检测Rapa和ROS响应水凝胶对巨噬细胞极化的调节,Western blot检测Akt信号通路相关蛋白的表达水平,MTT法检测不同浓度Rapa对巨噬细胞细胞活性的影响,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测炎症细胞因子表达水平。构建大鼠尾椎间盘退变模型,治疗12周后进行MRI、Micro-CT、流式细胞仪和组织学切片染色等检测,对比治疗后各组大鼠尾椎间盘退变情况;最后检测对比Rapa全身使用与原位注射Rapa@Gel组大鼠的体重及各项血液指标的差异。研究结果Rapa@Gel具有典型的水凝胶物理特征,在体内体外能够响应并清除ROS,材料降解同时对Rapa具有良好的缓释性能;此外Rapa@Gel具有良好的生物相容性。LPS和H2O2诱导炎症反应促进巨噬细胞M1型极化,而Rapa及ROS响应清除水凝胶均能促进巨噬细胞M2型极化;Rapa通过特异性抑制m TORC1表达,从而解除了对PI3K-Akt的负反馈抑制作用,Akt表达的增强能够促进巨噬细胞M2型极化;ROS响应清除水凝胶通过降低ROS水平抑制巨噬细胞M1型极化和促进M2型极化。大鼠退变尾椎间盘组织内ROS含量明显高于正常组,原位注射Rapa@Gel显著降低髓核组织内ROS水平,通过巨噬细胞极化的调节,有效改善椎间盘组织内的炎性环境,缓解大鼠尾椎间盘退变;此外,原位注射Rapa@Gel能够大大降低Rapa全身使用带来的副作用。研究结论载有雷帕霉素的ROS响应清除水凝胶（Rapa@Gel）不仅可以响应ROS实现Rapa的调节释放,还能起到清除ROS的作用;ROS响应清除水凝胶支架和Rapa均可促进巨噬细胞的M2型极化,使Rapa@Gel发挥协同作用,有效改善退变椎间盘组织内的炎性环境,促进组织修复,缓解椎间盘退变。此外,我们认为Rapa可通过特异性抑制m TORC1解除PI3K-Akt的负反馈抑制,Akt表达的增强促进巨噬细胞M2型极化,为我们提出的IVDD免疫治疗策略的临床转化提供了理论依据。第二部分巨噬细胞M2型极化调控分子机制研究研究目的巨噬细胞（Macrophages）是一类极具异质性的细胞群体,在不同免疫微环境作用下,可以分化为促进炎症的M1型巨噬细胞及抑制炎症、促进组织修复的M2型巨噬细胞。当巨噬细胞表面白介素4受体（IL-4R）被激活后,主要通过JAK-STAT6和PI3K-Akt两条信号通路驱动巨噬细胞M2型极化,但IL-4如何激活下游信号仍不清楚。我们课题组前期研究证实,受体酪氨酸激酶（Receptor protein tyrosine kinase,RTKs）被激活后,能够招募G蛋白抑制性α亚单位1和3（Gαi1/3）来介导PI3K-Akt-m TOR信号转导。本部分我们着重探索Gαi1和Gαi3（Gαi1/3）蛋白如何介导IL-4激活下游Akt等信号通路,以及Gαi1/3蛋白对巨噬细胞M2型极化的关键调控作用。研究方法在小鼠骨髓来源的原代单核巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDMs）及小鼠胚胎成纤维母细胞（Mouse embryo fibroblasts,MEFs）中,利用基因敲除,显性负性突变（Dominant negative mutation,DN）,慢病毒转染,腺病毒转染,CRISPR/Cas9等多种分子生物学手段调节Gαi1/3、IL4Rα、Gab1及APPL1等关键信号蛋白的表达水平;通过蛋白质印迹法（Western blot）检测信号通路相关蛋白的表达水平;通过聚合酶链式反应（PCR）检测M2型巨噬细胞标志基因的表达水平;利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）、免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）检测相关目标蛋白的结合;MTT法检测细胞活力的变化。最后我们构建了Gαi1/3 DKO的基因敲除小鼠,结合药理学干预进行动物在体实验,进一步验证Gαi1/3蛋白对IL-4激活下游信号转导及巨噬细胞M2型极化的关键调控作用。研究结果在BMDMs和MEFs中,Gαi1/3敲除或沉默能显著地抑制IL-4诱导的Akt信号激活;反之,Gαi1/3的过表达促进了IL-4对Akt的激活。功能研究表明,在BMDMs中,过表达Gαi1/3可以促进IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化;敲除或沉默Gαi1/3后,IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化能力下降。在Gαi1/3 DKO小鼠体内,注射IL-4/anti-IL-4复合物后甲壳素诱导的巨噬细胞M2激活被显著抑制。通过Gαi1/3沉默或敲除、构建显性阴性突变体以及通过敲除IL-4Rα的细胞内结构域,干扰IL-4Rα-Gαi1/3的结合,则会消除IL-4诱导的IL-4Rα内吞、内涵体转运和Akt的激活。此外,通过沉默内涵体衔接蛋白APPL1,IL-4诱导的IL-4Rα内涵体转运、Gab1-Akt活化和巨噬细胞M2极化被抑制;相反,过表达APPL1则促进IL-4诱导的IL-4Rα内涵体转运、Gab1-Akt活化和巨噬细胞M2极化。研究结论IL-4刺激后,Gαi1/3主要通过与IL-4Rα的细胞内结构域结合,同时与内涵体衔接蛋白APPL1相互作用,介导IL-4Rα的信号内涵体内吞,从而活化下游信号;Gαi1/3与IL-4Rα、APPL1的结合是BMDMs中IL-4Rα内涵体转运和Gab1-Akt活化所必需的;Gαi1/3介导IL-4Rα内吞和内涵体转运及下游Akt的活化,Akt的激活能够促进巨噬细胞M2型极化。总的来说,Gαi1/3蛋白是IL-4激活下游Akt等信号通路及巨噬细胞M2型极化的关键调控蛋白。