甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（Glycerophosphodiester phosphodiesterase,GDPD;EC3.1.4.46）是生物体内普遍存在的催化甘油磷酸二酯水解生成3-磷酸甘油和相应含羟基化合物（如胆碱、肌醇和丝氨酸）的一类酶。我们研究团队前期发现来源于激烈热球菌（Pyrococcus furiosus DSM 3638）的GDPD（pfGDPD）具有溶血磷脂酶D水解活性,但其催化溶血磷脂酰胆碱（LPC）反应过程产物的特征尚未阐明。本论文在已有基础上,进一步采用31P-NMR和质谱检测技术解析该酶水解LPC过程中产物生成的特性,并在此过程中首次观察到有甘油磷酸胆碱产物（GPC）的生成;针对所发现的这一独特现象,尝试采用分子生物学和晶体学技术手段研究酶催化反应过程中GPC的形成机理,相关研究为深入理解该酶的结构功能关系以及指导该酶的分子改造与下游应用奠定重要基础。具体展开的研究内容与结果如下:（1）野生型pfGDPD水解溶血磷脂酰胆碱反应过程产物特征的31P-NMR分析以1-棕榈酰-sn-3磷脂酰胆碱（16:0 LPC）为底物,采用31P-NMR分析野生型pfGDPD水解16:0 LPC反应过程中所形成的产物特征。结果发现:水解产物除了观察到有溶血磷脂酸（16:0 LPA）生成外,还发现有GPC的生成;进一步采用定点突变方法构建针对pfGDPD活性中心关键催化残基His17、His59的突变体（H17A、H59A、H17A-H59A）,结果发现:三个突变体在水解16:0 LPC过程中,其水解产物均为GPC,且没有观察到16:0 LPA生成;尝试以EDTA-2Na对组成酶蛋白活性中心的金属离子做进一步螯合处理,结果发现:利用螯合处理后的酶蛋白pfGDPD水解LPC,其水解产物中仍只观察到GPC的生成。以上结果表明:组成该酶活性中心的两个组氨酸（His17和His59）及金属离子与GPC生成无关。（2）野生型pfGDPD晶体结构解析为进一步精确阐明该酶催化水解16:0 LPC过程中产GPC的分子机制,我们尝试对其野生型酶蛋白的三维结构进行解析。采用Ni2+-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得高纯度的pfGDPD酶蛋白。通过对结晶条件筛选和优化获得野生型pfGDPD蛋白晶体,经X射线衍射获得分辨率为1.65（?）的衍射数据,并上传至PDB数据库（PDB:7E0V）。pfGDPD的三维构象采用了经典的TIM-barrel构象,由外围的九个α螺旋包围着八个β折叠构成的（α/β）桶状结构组成。其催化活性中心由由严格保守的His17、Asp18、Glu44、Asp46、His59、Glu111、Lys113残基构成,这些残基组成了一个电负性的裂隙,用于结合底物。（3）催化活性中心loop区域氨基酸对于酶蛋白水解LPC过程中GPC生成的影响研究通过对野生型pfGDPD结构进行分析,选取催化活性中心附近的两个loop,loop（60-63）、loop（67-72）上的一系列位点作为研究对象,为验证loop区域氨基酸对酶蛋白水解16:0 LPC过程中GPC生成的影响,在已有pfGDPD-H17A-H59A双突变的基础上,设计并构建含相应位点的三点突变,结果发现pfGDPD-H17A-H59A-D60A水解16:0 LPC过程中并未观察到GPC生成。进一步在野生型pfGDPD基础上构建针对D60位点的单点突变,验证发现单点突变体pfGDPD-D60A水解16:0 LPC的产物为16:0 LPA,且在此过程中没有观察到GPC的生成,该结果表明D60可能是导致GPC生成的关键氨基酸。（4）pfGDPD-D60A及D60A-16:0 LPC复合物的晶体结构解析为深入理解D60位点突变造成酶蛋白水解16:0 LPC不生成GPC的原因,我们尝试对该突变体的结构进行解析（PDB:7E2A）,并采用酶底物共孵育的方式解析获得D60A-16:0 LPC复合物晶体结构（PDB:7E2B）,其分辨率分别为2.08（?）和1.85（?）。通过与野生型酶蛋白结构进行对比分析,我们提出基于关键氨基酸D60的pfGDPD酶催化产GPC的机理假设,即D60通过活化水分子,来导致对脂肪酸酯键的亲核进攻,使其断裂。