为了建立检测牛奶中布鲁氏菌的套式PCR方法,根据布鲁氏菌的保守基因设计了五组共15对特异性的外部引物,用正交实验的方法对这15对引物进行PCR反应条件的优化,筛选出敏感性较好的4对外部引物。据此设计相应的4对内部引物,同样方法筛选出最佳的内部引物,最后确定了套式PCR试剂盒的内外引物分别是PG3PG4和PG1PG2,外部扩增PCR反应条件为：退火温度54.4℃,Mg²⁺浓度1.2 mM, rTaq酶0.25 μL,引物0.45μM, dNTP浓度0.2 mM；内部扩增PCR反应条件为：退火温度46.4℃,Mg²⁺浓度2.1 mM, rTaq酶0.05μL,引物0.4μM, dNTP浓度0.3 mM。对奶样中布鲁氏菌基因组的提取方法进行了探索,确定了目的病原基因提取的最佳方案,并使其规范化。制作了试剂盒的阳性对照与阴性对照,并对试剂盒进行初步组装,制定了操作规范,确定了试剂盒有效期为6个月。用试剂盒检测牛奶中常见的大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、乳酸菌、巴氏杆菌等细菌以及能引起奶牛流产的胎儿弯杆菌、弓形虫、隐孢子虫、沙门氏菌等病原,结果均为阴性,只有布鲁氏菌扩增出了预期的目的条带,说明套式PCR试剂盒的特异性良好。用牛奶对已知菌数的菌液进行倍比稀释,进行敏感性试验,套式PCR试剂盒的最小检出菌量为8 CFU·mL-1。应用本试剂盒与试管凝集试验分别检测148份临床奶样和与每份奶样对应的血清样本的结果是,与试管凝集试验相比,套式PCR试剂盒检测方法的敏感性为100%,特异性是96.24%,符合率为96.62%。结果表明,研制的布鲁氏菌套式PCR检测试剂盒稳定、可靠,灵敏度高,特异性强,可用于实际生产中检测奶样中布鲁氏菌。