【摘 要】
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目的添加TGF-β信号传导通路抑制剂将人诱导性多能干细胞（hiPSCs）进行为期7天的神经方向诱导,得到Pax6及Nestin阳性的神经前体细胞（NPCs）;筛选得到诱导第7天的hiPSCs源性NPCs与未分化hiPSCs差异表达的miR-34b-5p;通过miR-34b-5p的过表达,下调TGFBR2抑制TGF-β信号传导通路活性促进hiPSCs向神经类细胞的诱导分化。方法单层贴壁法体外培养hi
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目的添加TGF-β信号传导通路抑制剂将人诱导性多能干细胞（hiPSCs）进行为期7天的神经方向诱导,得到Pax6及Nestin阳性的神经前体细胞（NPCs）;筛选得到诱导第7天的hiPSCs源性NPCs与未分化hiPSCs差异表达的miR-34b-5p;通过miR-34b-5p的过表达,下调TGFBR2抑制TGF-β信号传导通路活性促进hiPSCs向神经类细胞的诱导分化。方法单层贴壁法体外培养hiPSCs,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,将hiPSCs诱导为神经前体细胞。在诱导分化的第7天采用RT-q PCR和免疫荧光检测神经前体细胞标志物Nestin、背侧前脑标志物Pax6的表达。采用micro RNAs高通量测序技术筛选出hiPSCs与hiPSCs源性NPCs差异表达的micro RNAs,与TGF-β信号通路关键因子进行相关性分析筛选得到直接靶向TGFBR2的miR-34b-5p。构建miR-34b-5p过表达及TGFBR2-RNAi的稳定hiPSCs,以未转染的hiPSCs作为对照细胞,采用N2/B27为基础培养基的单层贴壁培养方法进行为期7天的神经前体细胞的诱导分化,及为期25天的多巴胺（DA）能神经前体细胞的诱导分化,在诱导分化的2个时间点（第0天、第7天）采用RT-q PCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;神经前体细胞标志物Nestin和腹侧底板标志物Foxa2的表达;添加促进DA能神经前体细胞分化的SHH、FGF8a、Chir99021等相关细胞因子将hiPSCs向DA能神经前体细胞及早期DA能神经元进行诱导分化,采用RT-q PCR和免疫荧光检测诱导分化第14天DA能神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;加测诱导分化第25天神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。结果hiPSCs在诱导第7天能转化为Nestin、Pax6阳性的NPCs,添加TGF-β通路抑制剂可以显著增加Nestin、Pax6阳性的NPCs（p<0.05）;通过对hiPSCs与NPCs两个时间点样本高通量测序得到差异性表达的miR-34b-5p;双荧光素靶基因验证实验证实TGFBR2是miR-34b-5p的靶基因;过表达miR-34b-5p的i PSCs及TGFBR2-RNAi的i PSCs相对于对照i PSCs,在未分化状态下（D0）靶基因TGFBR2的表达明显下调（p<0.01）;TGF-β下游基因Lefty1的表达明显下调（p<0.01）;多能性基因Oct4的表达出现明显的增高（p0.05）;在诱导第七天（D7）miR-34b-5p过表达组i PSCs及TGFBR2-RNAi的i PSCs相对于对照i PSCs在Nestin的表达上有显著的增高（p<0.05）;继续向DA能神经前体细胞诱导分化实验结果显示:分化第十四天（D14）miR-34b-5p过表达i PSCs组相对于对照i PSCs在En1与Lmx1a的表达上有显著的增高（p0.05）;诱导分化第二十五天（D25）miR-34b-5p过表达组相对于对照i PSCs组在TH的表达上有显著的上调（p<0.05）。结论抑制TGF-β信号通路可以促进hiPSCs向Nestin阳性的神经前体细胞（NPCs）的诱导分化效率,miR-34b-5p可以通过靶向下调TGFBR2的表达抑制TGF-β信号传导通路活性,促进i PSCs向NPCs的诱导,同时miR-34b-5p还可以促进hiPSCs源性NPCs向DA能神经前体细胞以及早期DA能神经元的诱导分化。
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