研究背景由于肿瘤切除、深度烧伤、放射性治疗等导致的组织缺损和各种切口的瘢痕化愈合不仅导致外观畸形和局部功能障碍,还大大降低了病人生活质量,频繁的住院治疗也增加了发病率和死亡率,导致巨大的社会经济损耗。近年来人们都在努力寻求微创化或无瘢痕愈合的治疗方法。当前存在的诸多促修复方案虽然大大提高了创面愈合能力或者减轻了瘢痕的形成,但是还存在一些局限性,如创面覆盖物结合各种细胞因子的疗法价格昂贵且效果有限,组织瓣转移修复导致供区继发损伤和瘢痕遗留,假体填充治疗引起包膜挛缩等等。因此寻找理想的治疗方法促进创面修复以达到愈合组织的解剖重建和功能恢复是一直以来迫切需要解决的问题。随着干细胞研究技术令人鼓舞的革命性进步,在创伤部位有效补充外源性干细胞就成为促进创伤修复的理想策略。干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞,在特定的培养条件下可以分化成几种不同类型的细胞(成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞)。到目前为止,干细胞已经被广泛地用于治疗某些疾病。脂肪来源干细胞,主要因其取材方便、可反复获取,发展前景巨大,有望成为最常用的干细胞来源。已有研究证实,脂肪干细胞移植可有效促进创面的修复。2012年,Collawn SS等证实ADSCs可加速创面愈合。随后,亦有研究表明,脂肪干细胞移植可促进扩张皮肤的再生。公认的,干细胞疗法对加强创伤后组织重构和功能恢复具有重要的临床意义,而干细胞在体内的动员与归巢是其发挥作用的关键。干细胞归巢的“归巢”特性是体内干细胞修复损伤组织或替代坏死结构的基础。2004年Chen F等认为干细胞首先被动员从其聚集的组织或器官中移出并进入外周血,感受到指引其归巢的趋化因子浓度梯度,然后按信号指引方向迁移到组织损伤部位并粘附到血管内皮,黏附到血管内皮的干细胞随后要穿过血管壁从而进入靶组织,定植于新的有利于其增殖和免受程序性细胞死亡的微环境中,进一步分化成相关细胞,从而修复缺损组织。为了使移植的干细胞能够最大化被动员到创伤部位参与修复,我们认为首先要选择有利于干细胞存活及迁移的移植途径。目前常用的移植途径主要为局部移植,然而我们认为局部途径植入的干细胞虽然更直接且停留创伤部位的细胞数量更多,但是相比全身途径来说,操作较复杂且细胞植入起始环境差,会导致相当一部分的细胞流失,而且细胞活力会受到很大影响,另外,高密度细胞团在外周组织液中的迁移能力也是有限的。血管内注入的全身途径更有利于干细胞的存活和迁移,因为血液是细胞能够赖以存活的体内环境,不仅提供丰富的营养物质,血管内压力差还提供了促使细胞迁移的动力,但是静脉移植注入的干细胞首先要通过肺循环,肺组织存在丰富的毛细血管网,血流缓慢有利于细胞的贴壁粘附,而且肺组织为干细胞提供给了更适宜生存的氧分压环境,导致循环中大量的干细胞被滞留于肺而难以发挥其有效作用。近年来,有研究表明,动脉移植途径是进行干细胞移植的一条安全有效的途径。Makela T等就在其研究中指出静脉移植干细胞易导致大量的干细胞被滞留于肺而难以发挥其有效作用,而动脉移植有更大的潜能将细胞输送至全身血液循环,最终有效到达细胞疗法的靶器官,然而需要解决的问题是如何更有效地动员并引导循环中的外源性干细胞靶向迁移到待修复组织处。因此,我们想要寻找有效的ADSCs趋化因子。基质细胞衍生因子(SDF-1)由基质细胞产生,也常被称为CXCL12。早期研究者们发现,SDF-1可调节内皮祖细胞向创伤微环境的迁移和归巢,增强创面边缘SDF-1的表达有助于增加内皮祖细胞在创缘的累积,并且加速新生血管化。后来有研究表明,SDF-1也参与调控了外源性移植的骨髓间充质干细胞以及内源性的骨髓间充质干细胞的动员和归巢。然而相关的对于脂肪干细胞(ADSCs)迁移调控方面的研究尚不成熟。近年来有研究者发现,肝损伤可造成局部肝损伤区域SDF-1的表达升高,通过静脉移植的ADSCs可募集在局部肝损伤区域,证明通过血管移植的全身途径是行之有效的干细胞移植方法,且ADSCs向局部损伤部位的迁移可能与SDF-1的调控有关。目的意义本研究的目的在于探究SDF-1对于诱导ADSCs向创伤组织定向趋化迁移的作用,进一步验证通过调控SDF-1的局部浓度控制ADSCs向创伤组织的趋化迁移是否可行,为充分动员ADSCs发挥促修复作用寻找新策略,对于干细胞疗法的广泛应用也具有重要的临床指导意义。方法1.采用改良的酶消化法分离获得SD大鼠ADSCs,经体外培养、传代扩增细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态学特征,通过流式细胞检测细胞表面CD29、CD34^ CD45及CD90的表达,体外诱导细胞成脂成骨分化检测其多向分化能力。2.构建携带eGFP基因的慢病毒载体,以经验感染复数MOI=40转染第3代ADSCs,并且分别于转染后的24h、48h、72h、96h时,于荧光显微镜下观察ADSCs的绿色荧光蛋白的阳性表达情况,并于转染一周后,使用流式细胞检测ADSCs的eGFP阳性表达率。继续传代转染后的细胞至第九代,于荧光显微镜下观察,验证随着细胞的增殖传代,eGFP是否可以稳定表达。用MTT法检测Lentivirus-eGFP转染后ADSCs的细胞活性。对eGFP-ADSCs进行成脂成骨诱导分化,以检测转染后的细胞是否仍具备多向分化能力,且验证分化后的eGFP-ADSCs是否仍可表达绿色荧光蛋白(eGFP)。3.利用含有SDF-1的基础培养基对体外传代至第3代的ADSCs进行培养2天后,流式细胞技术及蛋白质印迹分析法检测其细胞中SDF-1受体CXCR4及CXCR7的表达情况,并与正常传代培养的第3代ADSCs进行比较。4.构建Transwell细胞迁移模型,检测体外SDF-1对ADSCs迁移的影响,并且设置SDF-1的浓度梯度为Oug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L,检测1-100ug/L浓度范围内,ADSCs的迁移与SDF-1浓度有无相关性。5.构建大鼠背部创伤模型,通过动脉移植途径向动物模型中注入eGFP-ADSCs,设置空白对照组(未做创伤处理,仅移植eGFP-ADSCs)、创伤组(大鼠背部创伤+eGFP-ADSCs移植)、SDF-1干预组(大鼠背部创伤+eGFP-ADSCs移植+局部SDF-1给药)。定期取大鼠背部创伤组织,利用Elisa法检测创伤组织中SDF-1在创面愈合过程中的表达趋势；利用RT-PCR检测创伤组织中eGFP基因的表达情况,并在共聚焦显微镜下观察eGFP-ADSCs在创伤组织冰冻切片中的迁移分布情况。定期采集大鼠循环血,利用流式细胞计数及RT-PCR法,对eGFP-ADSCs动员入循环血的情况加以分析。并于细胞移植后的21d,分别取三组大鼠血供丰富、氧分压较高的实质性器官——肺组织,进行冰冻切片,于共聚焦纤维镜下观察eGFP-ADSCs在肺部组织中的分布,利用RT-PCR检测肺组织中eGFP基因的表达情况。6.实验过程中,分别于创伤后1d、3d、7d、14d、21d,观察记录两组创伤大鼠创面愈合的情况,计算创面愈合率；并于创伤后7d采集两组大鼠创面组织进行CD31免疫组化染色,比较两组创面组织中毛细血管密度。结果1.倒置显微镜下观察,分离培养的大鼠ADSCs呈梭型或多角形,流式细胞技术检测ADSCs表面高表达间充质干细胞的表面标志物CD2、CD90;基本不表达造血及内皮细胞表面标志物标记物CD34、CD45。体外成脂诱导培养14d后,油红O染色阳性,证明其具有成脂分化能力；体外成骨诱导培养28d后,茜素红染色阳性,证明其具有成骨分化的能力。2. Lentivirus-eGFP转染第3代ADSCs,96h时,细胞的绿色荧光表达程度达到高峰,此后维持在较高水平稳定表达。连续传代培养至第9代,细胞绿色荧光表达情况仍无明显变化。转染一周后,经流式细胞仪检测,Lentivirus-eGFP转染后ADSCs的eGFP阳性表达率为81.92%(图2-4),可满足本实验的需求。MTT检测结果显示Lentivirus-eGFP转染后的ADSCs与未转染的ADSCs在细胞活性方面差异无统计学意义。对eGFP-ADSCs进行多向分化能力检测,体外成脂诱导培养14d后,油红O染色阳性,体外成骨诱导培养28d后,茜素红染色阳性,证明慢病毒转染并未对其多向分化能力造成影响。3.流式细胞结果显示,ADSCs在体外培养传至第3代(P3 ADSCs),其表面SDF-1受体CXCR4、CXCR7的阳性表达率很低,分别为3.0%、4.1%,经SDF-1处理2d后,P3 ADSCs表面CXCR4、CXCR7的阳性表达率明显上调至33.7%、26.4%。Western blot实验结果同流式细胞结果基本一致,P3 ADSCs中CXCR4与CXCR7表达水平较低,经SDF-1处理后表达明显提高。因此说明经SDF-1诱导可有效提高传代后ADSCs表面CXCR4与CXCR7的表达水平。4. Transwell细胞迁移实验中,当下室加入SDF-1后,ADSCs细胞迁移数目明显增加,SDF-1浓度为Oug/L、lug/L、10ug/L、100ug/L时,ADSCs的细胞迁移率分别为9.77%、13.45%、28.14%、49.14%,各组间差异有统计学意义(P<0.05),证明了SDF-1在体外对ADSCs的迁移有诱导作用,且在0-100ug/L的范围内,诱导作用呈正相关关系,即SDF-1浓度越高ADSCs迁移越明显。5.Elisa法检测组织中SDF-1含量显示,未致创大鼠所取的组织中即正常皮肤组织亦构成性地表达SDF-1,但表达水平较低,在皮肤致创后即刻至第24h,创伤组织中SDF-1水平呈上调趋势,24h时出现SDF-1水平的小高峰,此后在24h-72h间,SDF-1的表达略有下调,72h-7d间SDF-1水平重又上升,7d时达到整个愈伤过程的最高峰,随后SDF-1水平随创伤的愈合逐渐下降。经外源性SDF-1干预后,创伤组织SDF-1水平在24h-7d间呈稳定上升趋势,未出现明显波动,7d后直至21d,随创面愈合,SDF-1水平显著下降。6.共聚焦显微镜下观察发现,细胞移植后的第1天,eGFP-ADSCs开始少量出现在大鼠创伤组织中,随着时间的迁移,eGFP-ADSCs细胞量逐渐增多,并大致分布于表皮组织、腺体及血管周围。我们利用ImagePro Plus图像软件对切片绿荧光强度进行分析,结果显示,SDF-1干预过的创伤大鼠,其创面组织中eGFP-ADSCs的含量在3d、7d、14d及21d均高于未予SDF-1干预的创伤大鼠。RT-PCR检测各组创伤组织中eGFP基因的表达情况,其结果与冰冻切片的观察结果基本吻合。细胞移植后第21d,对各组大鼠的肺部组织取材进行冰冻切片及RT-PCR检测,结果显示,未创伤大鼠肺组织中eGFP-ADSCs含量较另外两组明显较多,其中SDF-1干预的创伤大鼠肺组织中eGFP-ADSCs含量最少。7.流式细胞分析结果提示,创伤组大鼠及SDF-1干预的创伤组大鼠与空白对照组大鼠相比,循环血中eGFP-ADSCs含量较多；RT-PCR检测循环血中eGFP基因表达情况显示,各时间点循环血中eGFP基因的表达情况：SDF-1干预的创伤组大鼠>创伤组大鼠>对照组大鼠。8.移植ADSCs的创伤大鼠在给予外源性SDF-1处理后,其创面愈合速度较未予SDF-1处理的加快,SDF-1处理组的创面愈合率在伤后7d、14d均高于对照组。创伤后7d,取大鼠创面组织进行CD31免疫组化染色,结果显示,SDF-1处理后的创伤组织中毛细血管密度明显高于未予SDF-1处理的创伤组织。结论1.利用携带eGFP基因的慢病毒转染ADSCs获得eGFP标记的ADSCs,可稳定表达eGFP绿色荧光,且不受细胞传代增殖分化的影响,转染后ADSCs的生物学特性亦未受明显影响,因此可满足动物体内实验的需求。2.体外培养传代的ADSCs至P3(第三代)时,其表面SDF-1受体CXCR4及CXCR7的阳性表达率很低,但在基础培养基中加入SDF-1诱导培养2d后,其表面CXCR4及CXCR7的阳性表达率可明显提高。在体外,SDF-1可促进ADSCs的跨膜迁移,在0-100ug/L的范围内,随SDF-1浓度的提高,ADSCs的迁移越明显。3.动物体内实验中,创伤因素可致创伤组织局部SDF-1水平的上调,创伤本身就可动员ADSCs入血并向创伤组织部位迁移,而外源性SDF-1可叠加该作用,增强移植ADSCs的动员与归巢,减少其向非目的实质性器官的迁移。移植ADSCs可参与皮肤创面愈合过程并能促进创面的愈合,而SDF-1在募集ADSCs参与创面愈合过程中发挥着重要的作用。