研究背景和目的高脂血症是一种脂质代谢紊乱性疾病,其特征是血液中一种或多种脂质或脂蛋白水平异常。通常,高脂血症的发生与遗传、环境及饮食习惯有关。其中,饮食诱导的脂质代谢紊乱是引发高脂血症的主要风险因素。从食物中摄取过多的脂质及体内脂质代谢异常均可诱发高脂血症。流行病学研究与临床试验表明高脂血症可诱发动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑梗等一系列心脑血管疾病。现如今,在中国的农村和城市由心血管系统疾病所导致的死亡率分别占41.09%和41.52%。同样,在美国大约也有1/6的人群患有高脂血症。随着全球心血管疾病发病率的增加,如何预防和治疗高脂血症已经成为整个医学界的首要问题和巨大挑战。临床应用的一线调整药如他汀类、贝特类,可快速有效的降低血清脂质水平。然而,由于部分高脂血症患者在使用过程中出现的药物不良反应及其依赖性使其临床应用受到了限制。与此相比,天然产物及其衍生物在预防和治疗高脂血症中可能具有多环节、多靶点的综合作用,发挥出独特的疗效,并且多部分天然药物的不良反应相对轻微、且来源广泛、成本低等优势。毛冬青皂苷(Pedunculoside, PE),提取自冬青科冬青属植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮,为五环三萜类化合物。现代药理学研究表明其具有清热解毒,消肿止痛功效。用于感冒,扁桃体炎,咽喉肿痛,急性胃肠炎,风湿骨痛；外用治跌打损伤,痈疖疮疡,外伤出血,烧烫伤等。本论文研究PE的调脂活性并初步探讨其潜在的作用机制,为天然调脂药物的开发提供实验依据。方法第一部分：预试验,高脂饮食建立高脂血症动物模型,确定试验动物、高脂饲料配方、造模周期,建立合理、安全、有效的高脂血症动物模型。第二部分：建立高脂饮食诱导的高脂血症大鼠模型,灌胃给予受试药PE(5,15,30 mg/kg/d)及阳性对照药辛伐他汀(Simvastatin, Sim 10 mg/kg/d),连续7周。试验期间,每周测量大鼠体重、摄食量。试验从第3周至第7周,每周测定大鼠血清脂质含量。试验结束,处死大鼠,测定肝脏组织中TC、TG含量。制作肝脏及脂肪切片,观察PE对肝脏中脂质浸润及脂肪细胞的影响。RT-PCR测定肝脏组织中脂质代谢相关基因的表达。分离大鼠心、肝、脾、肺、肾、脂肪,称重、计算脏器系数并且进行组织形态学检查,观察有无病理改变。第三部分：体外培养3T3-L1前脂肪细胞,MTT法检测PE对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响。使用含胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)诱导剂诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,诱导期间使用不同浓度PE干预。诱导结束测定细胞内TG含量,油红O染色。第四部分：诱导分化第9天,提取细胞总蛋白,Western Blot测定CCAAT增强结合蛋白α(CCAAT-enhancer-binding proteins-a, C/EBPa)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-y, PPAR-y)、固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1)脂肪分化相关蛋白表达及AMPK信号通路的活化。结果第一部分：SD大鼠给予高脂饲料(67.5%基础饲料,10%猪油,10%蛋黄粉,10%蔗糖,2%胆固醇,0.5%胆盐)喂养4周,与正常组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低(p<0.001)。肝脏体积增大且肝细胞中有大量脂肪浸润,表明成功构建高脂血症大鼠模型。第二部分：PE 5、15、30mg/kg可显著降低大鼠血清TC、TG、LDL-C含量,并且显著升高血清HDL-C含量(p<0.001)。5、15、30mg/kg PE对大鼠肝脏组织匀浆TC、TG含量亦有显著降低作用(p<0.001)。肝组织H&E及油红O染色结果显示PE可显著改善肝脏组织脂质浸润。PE 15、30mg/kg可显著降低脂肪重量(p<0.05,p<0.01)及脂肪直径(p<0.001)。RT-PCR结果显示PE 5、15、30mg/kg可显著下调肝组织中SREBP-lc、FAS、SCD-1基因表达(p<0.001),PE 30mg/kg对PPAR-α基因表达有显著上调作用(p<0.001)。此外,组织形态学检查重要脏器未见异常。第三部分：MTT结果显示PE在25-100μmol/L浓度范围时对3T3-L1前脂肪细胞增殖无显著影响,表明PE在该浓度范围内对3T3-L1前脂肪细胞无毒性。PE25、50、100μmol/L可显著降低脂肪细胞内TG含量(p<0.001),且呈剂量依赖性。油红O染色结果显示PE显著减少成熟脂肪细胞中脂滴数量。第四部分：Western Blot结果显示PE 25、50、100μmol/L可显著下调脂肪细胞中PPAR-γ蛋白表达(p<0.01,p<0.001)。PE 50、100μmol/L对脂肪细胞中C/EBPα、SREBP-1蛋白表达也有显著的下调作用(p<0.01,p<0.001)。此外,PE 25、50、100μmol/L可显著上调脂肪细胞中p-AMPK蛋白表达(p<0.01,p<0.001)结论(1)PE可显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,调节脂质代谢,显著改善肝组织脂肪浸润。(2)PE可通过调节肝脏中脂质生成及脂肪酸β氧化相关基因表达进而改善高脂饮食诱导的大鼠高脂血症。(3)PE显著降低分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中脂质含量,其机制可能与活化AMPK信号通路和下调脂肪生成相关蛋白PPAR-γ、C/EBPα、SREBP-1表达有关。