【摘 要】
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疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶由于其具有的良好耐温特性,被广泛地应用于饲料、油脂加工和生物柴油等领域。另一方面,应用领域的拓展对脂肪酶的特性和经济性提出了更高的要求。为了使脂肪酶可以更好地应用于相应的领域中,本研究通过理性设计T.lanuginosus脂肪酶,获得到了高酶活与高耐热性的脂肪酶品种,为脂肪酶的应用奠定基础。为了获得具有高酶活和高耐热性的脂肪酶
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疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶由于其具有的良好耐温特性,被广泛地应用于饲料、油脂加工和生物柴油等领域。另一方面,应用领域的拓展对脂肪酶的特性和经济性提出了更高的要求。为了使脂肪酶可以更好地应用于相应的领域中,本研究通过理性设计T.lanuginosus脂肪酶,获得到了高酶活与高耐热性的脂肪酶品种,为脂肪酶的应用奠定基础。为了获得具有高酶活和高耐热性的脂肪酶菌株,本研究对T.lanuginosus脂肪酶典型结构域lid和loop区域的系统发育分析,找到并选定合适的突变位点。通过将第91位Gly突变为Ala和将227位的Leu突变为Gly,分别优化了脂肪酶lid区域和loop区域的结构以提高酶活与温度稳定性。构建毕赤酵母Pichia pastoris表达系统并获得了脂肪酶活性和耐高温特性显著提高的脂肪酶重组子PAO815-tll2a,经诱导表达后与野生型T.lanuginosus脂肪酶的酶活比较,酶活力提高了251.8%,同时进行了酶学性质的测定,其突变体脂肪酶TLL2A的高温稳定性显著提升,在80℃下放置12 h后仍保留78.94%的酶活。利用设计后的脂肪酶基因构建多拷贝载体,并用荧光定量PCR测定了P.pastoris脂肪酶基因的拷贝数。优化并完成了在50-L发酵罐中的高密度发酵,并测定了产酶能力,四拷贝脂肪酶TLL2Q在50-L发酵罐中发酵,诱导168 h后其上清液酶活达到29,000 U/m L。通过对脂肪酶TLL的理性设计,成功设计并获得了一种新型的高活性、耐高温的脂肪酶品种TLL2A,并实现了高效表达,为其产业化和工业应用奠定了基础。
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