论文部分内容阅读
向日葵黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahlia Kleb.）侵染所致的一种严重危害向日葵生产的真菌病害,一旦发生很难得到有效的控制。微菌核是大丽轮枝菌主要的初侵染来源,在土壤中能够存活数十年。目前关于微菌核的形成机制和致病机理的研究还很少。本研究通过探究外源添加环腺苷酸（cAMP）对向日葵大丽轮枝菌的生物学特性及致病力的影响、构建大丽轮枝菌的T-DNA突变体库、分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因的功能,得出如下结论：1.外源添加cAMP能够显著提高向日葵大丽轮枝菌的产孢量,但对其生长速率、分生孢子萌发率、微菌核形成的数量、粗毒素分泌量以及致病力均有不同程度的抑制作用,其中以对向日葵微菌核形成的抑制作用最为明显。2.利用农杆菌介导的遗传转化体系,将带有潮霉素抗性标记和GFP报告基因的双元载体对大丽轮枝菌的分生孢子进行了遗传转化。通过潮霉素抗性标记的筛选,共获得了包含有800株阳性转化子的大丽轮枝菌的突变体库。3.随机挑取42株阳性转化子,对其菌落形态,菌丝生长速率,产孢量,粗毒素含量和致病力进行了研究。结果表明,42株阳性转化子中有4株转化子的菌落只产生白色气生菌丝,不能形成黑色的微菌核。相比对照,所测定的42株转化子的生长速率均有不同程度的降低；但是产孢量却表现出不同的变化趋势。粗毒素分泌量的测定结果表明,粗毒素分泌量升高的转化子有5株,而表现为下降趋势的转化子有27株。致病力测定的结果表明,致病力增强的转化子有4株,而28株转化子的致病力呈现降低的趋势,其余10个转化子的致病力与对照没有显著差异。4.利用hiTAIL-PCR的方法对20株突变体插入位点的右侧序列进行了扩增,共得到大小介于200-1200bp之间12个突变体插入位点的右侧序列。筛选到了2个与微菌核形成相关的候选基因Initiation-specific a-1,6-mannosyltransferase （VDAG02820）和Aryl-alcohol dehydrogenase （VDAG03323）,通过功能预测分析将这两个基因命名为VdOCH1和VdAAD。5.通过同源重组的方法获得VdOCH1基因的敲除和互补突变体。功能分析结果表明,该基因不仅与大丽轮枝菌细胞壁的完整性有关,还能够调控病原菌的生长发育和微菌核的形成,并能影响大丽轮枝菌菌丝的穿透能力。此外,敲除VdOCHl基因能够降低病原菌的致病力。6.通过同源重组的方法获得VdAAD互补突变体。功能研究的结果表明,该基因不仅调控大丽轮枝菌的生长发育,而且调控病原菌微菌核的形成能力、粗毒素分泌量和致病力。