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背景与目的据《中国健康卫生统计年鉴》,2020年我国乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）携带者仍有8000多万人,其中有接近3000万慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者需要治疗。得益于疫苗的接种,2014年的数据表明1～4岁的儿童乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBsAg）的流行率已经降至0.32%。在目前高达90%新生儿乙肝疫苗接种概率上,为达到“2030年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁”的目标,在既往的预防措施基础上做好目前CHB感染者的管理及诊疗很是紧要。尽管目前有核苷（酸）类似物（Nucleos（t）ide Analogue,NAs）延缓CHB患者肝病的进展,但是这对完全治愈CHB是不够的;以治愈CHB为目标,坚持探索HBV的感染机制、开发新型药物和免疫干预措施是十分必要的。作为传统中药苦参的成分之一,苦参碱具备抗HBV及调节免疫系统的作用,但是其作用机制尚不清楚。本研究立足于苦参碱抗HBV的临床效果,通过对苦参碱的机制的进一步研究,试图进一步了解HBV的感染机制、中药的抗病毒机制,为新药研发者提供新的思路。方法人肝癌细胞HepG2.2.15细胞系经过含有不同浓度的苦参碱的最低必需培养基（Minimum Essential Medium,MEM）处理,7 天后收集上清液及 HepG2.2.15 细胞,采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）-荧光探针法技术检测上清液中乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA）表达量;采用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和转录激活因子 2（Activating Transcription Factor 2,ATF2）、环磷腺苷效应元件结合蛋白 3（cAMP-response element binding protein 3,CREB3）磷酸化和非磷酸化蛋白的表达,采用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 CXC 趋化因子 8（C-X-C Motif Chemokine Ligand 8,CXCL8）表达水平;通过串联质谱标签（Tandem mass tag,TMT）标记、修饰富集技术、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）、液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrumetry,LC-MS/MS）联用的方法,进行磷酸化蛋白质组学定量研究,对差异修饰蛋白及位点定量统计。并对差异修饰位点对应蛋白的功能富集分析、激酶网络预测,分析差异修饰蛋白的定位及功能并找到作用的关键激酶。蛋白激酶C抑制剂处理HepG2.2.15细胞后,采用Western blot检测细胞MAPK和ATF2、CREB3磷酸化和非磷酸化蛋白的表达,ELISA检测CXCL8表达水平。结果1.苦参碱抑制HBV复制,与对照组相比,HepG2.2.15细胞经过含有不同浓度苦参碱的细胞培养基处理,其上清中HBV-DNA的表达水平明显降低（P＜0.001）。上清中HBV-DNA的表达水平与苦参碱药物浓度有量效关系（P＜0.05）;2.HepG2.2.15细胞经过含有不同浓度苦参碱的细胞培养基处理,CXCL8在HepG2.2.15细胞中表达水平明显升高（P＜0.01）;3.将经过含有不同浓度苦参碱的细胞培养基处理的HepG2.2.15细胞进行磷酸化蛋白质组分析,相较于对照组,苦参碱可明显改变细胞中蛋白的磷酸化水平（P＜0.001）。发生磷酸化修饰位点上下游大多为天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸基序,另外发生磷酸化修饰的主要是核蛋白;4.HepG2.2.15细胞经过含有不同浓度苦参碱的细胞培养基处理,PKC的表达明显受到抑制（P＜0.001）,MAPK1磷酸化水平明显降低（P＜0.001）,ATF2、CREB3磷酸化水平增加（P＜0.001）;5.在 HepG2.2.15 细胞中,小干扰 RNA（Small interfering RNA;siRNA）-PKC组细胞相比对照组MAPK1磷酸化水平变化不明显（P＞0.05）,ATF2、CREB3磷酸化水平增加（P＜0.001）;6.在HepG2.2.15细胞中,siRNA-PKC组CXCL8表达水平明显升高（P＜0.01）。结论1.苦参碱下调HepG2.2.15细胞中蛋白激酶C的活性;2.在苦参碱作用下,HepG2.2.15细胞中ATF/CREB-CXCL8信号通路受蛋白激酶C调节;3.苦参碱通过PKC/MAPK-ATF2/CREB信号通路刺激炎症性趋化因子CXCL8高表达,抑制HBV复制。