目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD),是一种由气道炎症和气道重塑导致的、以持续性气流受限为特征的、可以预防和治疗的疾病,是呼吸系统的常见病、多发病,推测到2030年在世界范围内可能成为第三大致死疾病。COPD除了引起呼吸衰竭、心力衰竭、气胸等常见的并发症,其危害远不止于此,它还可以导致营养不良、体重减轻、骨骼肌萎缩、骨骼肌功能障碍。有确切报道COPD营养不良的发生率可达50%以上,营养不良常使COPD患者骨骼肌显著耗竭,从而导致骨骼肌功能障碍,患者活动耐力下降,生活质量显著下降。临床中COPD患者的营养状态越来越引起患者及医务人员的关注,因此进一步研究COPD骨骼肌功能障碍的潜在病理生理机制,从而探索新的治疗方法就越来越显得重要。COPD最主要的病理生理机制就是人体对吸烟等有害气体造成的慢性气道炎症,此外,长期重度吸烟与慢性阻塞性肺病也可导致骨骼肌萎缩,加速慢性阻塞性肺病的发病过程。骨骼肌的功能障碍也会反馈性的加重肺损伤和恶化肺功能,导致COPD患者发病和死亡。然而,与COPD相关的骨骼肌营养不良的发病机制尚不清楚。有报道称COPD相关缺氧可引起炎症,导致骨骼肌组织前炎症因子如TNF-α和IL-6等产生增加,从而进一步损害肌细胞。此外,肌生成受到肌原蛋白等如肌生成素的正向调控,受肌生成抑制素的负向调控。有文献证实,增强的氧化应激和炎症可上调肌生成抑制素的表达,并下调肌生成素的表达,使骨骼肌萎缩过程恶化。因此,调节这些靶点的治疗策略可能抑制COPD相关骨骼肌萎缩的过程。另外众所周知,肌肉生长是蛋白合成和降解动态平衡的过程,这里面包含两个重要的信号通路参与,IGF1–PI3K–Akt–mTOR是正向调节信,myostatin–Smad2/3是负向调节信号。红景天是我国传统中草药,是景天科、红景天属、多年生、亚灌木或草本植物,《本草纲目-草部》中记载了红景天具有“扶正固本,补气养血”等功效,乃“草本上品”。红景天苷(Salidroside)作为一种传统药物在东欧和亚洲被广泛应用。先前的研究表明,红景天苷具有潜在的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗疲劳和缺氧、抗COPD作用,且有研究证实红景天苷能减轻肺癌小鼠恶病质状态下腓肠肌的丢失,增加腓肠肌肌球蛋白重链的表达,且是通过IGF1–PI3K–Akt–mTOR通路实现的。另有报道,4周红景天和红景天苷灌胃可抑制腓肠肌和比目鱼肌中p-smad3表达。然而,对于红景天苷治疗是否可以改善与COPD相关的骨骼肌功能障碍,以及是否通过上述两条信号通路,尚没有深入研究。本研究旨在通过体内实验模拟吸烟的过程,建立COPD大鼠模型,观察COPD致大鼠骨骼肌功能障碍的病理生理学及功能学变化,评价红景天苷对COPD相关骨骼肌功能障碍的保护作用,并通过评估炎症因子、氧化应激水平变化及用分子生物学方法从myostatin及myogenin基因和蛋白的表达水平,探讨红景天苷改善骨骼肌功能障碍的机制。另外,进一步研究线粒体超微结构、能量代谢变化及TGF-β-smad和PI3K-akt信号通路在香烟烟雾诱导的大鼠COPD相关的骨骼肌功能障碍的作用及红景天苷的保护机制。方法:1、慢性烟雾暴露致大鼠骨骼肌功能障碍的表现雄性SPF级wistar大鼠16只,按随机数字表法将大鼠随机分组,分为对照组(control,n=8)和模型组(COPD,n=8)。采用全身口鼻全相态/烟雾毒性实验设备,大鼠口鼻全身暴露于染毒内腔,香烟燃烧发生器每次点燃10支香烟,之后接续点燃5-10支,维持烟雾浓度6%-8%,共12周,每周6天,每天2次,每次30分钟,复制大鼠COPD模型,对照组不熏烟。在整个COPD造模过程中,密切观察大鼠的精神状态,性情变化,对外界反应能力及抓力、体重变化情况。用YLS-13A大小鼠抓力测定仪测定大鼠的抓力,用自制的游泳设施测量大鼠负重游泳时间评估肌力变化。将大鼠气管插管,连接AniRes2005动物肺功能分析系统,测量FEV0.2、FVC及PEF评估造模成功与否。HE染色观察肺组织及腓肠肌组织的结构形态。Western blot方法检测myostatin及myogenin蛋白表达。电镜下观察骨骼肌线粒体超微结构的变化。2、红景天苷通过调节myostatin和myogenin改善长期烟雾暴露诱导大鼠COPD骨骼肌功能障碍的作用机制雄性SPF级wistar大鼠40只,按随机数字表法将大鼠随机分组,分成5组,每组8只(n=8):对照组(control),不熏烟+相同时间注射等体积的灭菌注射用水;慢性阻塞性肺疾病组(COPD),熏烟+相同时间注射等体积的灭菌注射用水;50mg/kg低剂量红景天苷治疗组[COPD+Sal(50 mg/kg)],熏烟+相同时间注射50mg/kg的红景天苷;100mg/kg中剂量红景天苷治疗组[COPD+Sal(100mg/kg)],熏烟+相同时间注射100 mg/kg的红景天苷;200mg/kg高剂量红景天苷治疗组[COPD+Sal(200mg/kg)],熏烟+相同时间注射200 mg/kg的红景天苷。按照第一部分方法制备COPD大鼠模型,大鼠连续熏烟及用药16周。各COPD组在每日熏烟前分别接受了不同剂量的红景天苷(0,50,100,200mg/kg,腹腔注射法)。在观察点结束时,观察大鼠的精神状态,性情变化,进食水,及体重变化情况。按照第一部分方法测量肌力及肺功能。同样方法HE染色观察肺组织及腓肠肌组织的结构形态。免疫组化、Western blot、实时荧光定量PCR方法检测myostatin及myogenin蛋白及基因表达。3、TGF-β-smad和PI3K-akt信号通路在吸烟诱导COPD大鼠骨骼肌功能障碍中的作用及红景天苷的保护机制按照第二部分方法分组及制备COPD模型,取腓肠肌组织并树脂包埋,超薄切片机切片并于透射电镜下观察腓肠肌细胞线粒体的超微结构变化。用细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒及ATP合酶活性测定试剂盒评估线粒体能量代谢程度。Western blot方法检测不同肌纤维类型slow、fast蛋白的表达差异;肌萎缩相关蛋白MaFbx、MuRF1的表达差异;及不同通路蛋白smad2/3、p-smad2/3、akt、p-akt的表达差异。结果:1、慢性烟雾暴露致大鼠骨骼肌功能障碍的表现利用全身口鼻全相态/烟雾毒性实验设备制作大鼠COPD动物模型。观察COPD组大鼠与对照组相比,体型瘦小,一般状态差,毛色枯黄,精神萎靡,眼神呆滞,对外界刺激的反应明显迟钝,行动迟缓,懒动,且随着对烟雾暴露的时间延长,上述症状呈逐渐加重趋势。从肺功能上比较,COPD组大鼠与对照组比较,PEF、FEV0.2/FVC明显减低,P<0.001。大体解剖比较,对照组形态光滑圆润、颜色鲜亮、白色至淡粉色,COPD组形态粗糙、表面不平,颜色晦暗、灰色至黑色。HE染色后光镜下比较,COPD组肺泡壁变薄,肺泡腔扩大、破裂,MAN明显减低,MLI明显增加,P<0.001。从体重上比较,COPD组大鼠与对照组比较,体重明显减轻,在造模第一周结束的时候差异即达到统计学意义,P<0.05,第二周结束的时候差异更显著,P<0.001,随着时间的推移,逐渐出现了明显的体重增长缓慢的趋势。骨骼肌重量(左侧腓肠肌重量)在烟雾暴露12周时比较差异也达到统计学意义。COPD组大鼠与对照组比较,抓力明显减低,P<0.001,但负荷游泳时间没有减低,且有所延长,P>0.001。腓肠肌的HE染色提示,COPD组CSA较对照组明显减低,提示COPD合并骨骼肌萎缩。Western blot结果提示,COPD组大鼠myostatin蛋白表达较对照组明显升高,myogenin蛋白表达明显减少。电镜下观察线粒体超微结构,对照组大鼠腓肠肌细胞线粒体形态规整,膜光滑,嵴呈纵行或同心圆排列、结构清晰,COPD组大鼠腓肠肌细胞线粒体明显肿胀变性,膜模糊不清,部分破裂,嵴破坏甚至消失,线粒体数量减少甚至消失,形成空泡化。2、红景天苷通过调节myostatin和myogenin改善长期烟雾暴露诱导大鼠COPD骨骼肌功能障碍的作用机制红景天苷干预组能明显改善COPD大鼠的一般状态,表现为对外界刺激的反应明显较单纯COPD组增强,高剂量(200mg/kg)红景天苷组效果最明显。改善COPD大鼠的肺功能,表现为FEV0.2/FVC明显改善,中高剂量组均达P<0.001,PEF也较COPD组改善,高剂量(200mg/kg)红景天苷组效果最明显P<0.001。肺组织HE染色上观察,红景天苷干预组能明显改善COPD大鼠的组织病理学形态,表现为肺泡腔扩大得以改善,MAN较COPD组增多,低剂量组达P<0.01,中高剂量组达P<0.001,MLI较COPD组降低,中剂量组P<0.05,高剂量(200mg/kg)红景天苷组效果最明显,P<0.001。从体质量上比较,红景天苷干预后,大鼠体重较单纯COPD组有所增加,在高剂量组(200mg/kg)达统计学意义,P<0.05,肌肉重量有所增加,在高剂量组达P<0.01,提示红景天苷可以缓解COPD引起的大鼠体重延迟增长,并且具有一定的量效关系。功能上比较,红景天苷干预组能明显改善COPD大鼠的抓力,中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.001,而负重游泳时间COPD组长于对照组,但未达到统计学差异,红景天苷干预组负荷游泳时间较COPD组增高,中剂量组达统计学意义,P<0.05,高剂量P<0.01。肌肉组织HE染色光镜下观察其结构,表现为红景天苷干预组能明显增加COPD大鼠的肌纤维横断面积,中剂量组P<0.01,高剂量组效果最明显,P<0.001。通过ELISA方法检测炎症因子变化,红景天苷干预组明显降低COPD大鼠TNF-α的产生,血清中在高剂量红景天苷组效果较明显,达P<0.01,骨骼肌组织匀浆中在中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.001,红景天苷干预组也明显降低COPD大鼠IL-6的产生,血清及骨骼肌组织匀浆中均达到在中剂量组,P<0.01,高剂量红景天苷组,P<0.001。通过化学反应检测氧化应激水平,红景天苷干预组明显降低COPD大鼠的MDA水平,血清中在中高剂量组达P<0.001;组织匀浆中在中剂量组P<0.01,高剂量组P<0.001。红景天苷干预组明显提高SOD活力,血清中在中高剂量组达P<0.001;组织匀浆中在中剂量组P<0.01,高剂量组P<0.001。红景天苷干预组明显提高GSH的水平,血清中在中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.01;组织匀浆中在中剂量组P<0.05,高剂量组P<0.001。Western blot方法检测蛋白表达,红景天苷干预组明显降低COPD大鼠myostatin的蛋白表达,中剂量组达P<0.01,高剂量组达P<0.001;增加myogenin的蛋白表达,中剂量组达P<0.05,高剂量组达P<0.01。实时定量PCR方法检测基因表达发现,红景天苷干预组明显降低COPD大鼠myostatin的基因表达,高剂量组达统计学意义,P<0.01;增加myogenin的基因表达,中高剂量组均为P<0.01,与蛋白表达一致。免疫组化方法检测蛋白表达发现,红景天苷干预组明显降低COPD大鼠myostatin的蛋白表达,高剂量组达统计学意义,P<0.001;增加myogenin的蛋白表达,高剂量组达统计学意义,P<0.01。与Western blot及PCR方法得出的结果一致。3、TGF-β-smad和PI3K-akt信号通路在吸烟诱导COPD大鼠骨骼肌功能障碍中的作用及红景天苷的保护机制从超微结构上观察,对照组大鼠腓肠肌细胞线粒体形态规整,膜光滑,嵴呈纵行或同心圆排列、结构清晰;COPD模型组大鼠腓肠肌细胞线粒体明显肿胀变性,膜模糊不清,部分破裂,嵴破坏甚至消失,线粒体数量减少甚至消失,形成空泡化;应用红景天苷后由低至高剂量组大鼠腓肠肌细胞线粒体上述表现逐渐减轻。从能量代谢的角度评估,大鼠腓肠肌组织线粒体中细胞色素C氧化酶、ATP合酶活性在COPD组中分别为(881.3±180.7)U/mgprot及(11.7±3.14)U/mgprot,与对照组比较明显下降,应用红景天苷后细胞色素C氧化酶活性逐渐升高,至高剂量组达P<0.01;ATP合酶活性逐渐升高,在中高剂量组分别达到(16.44±2.77)U/mgprot及(19.25±2.56)U/mgprot,差异均有统计学意义,中剂量组为P<0.05,高剂量组为P<0.001。在不同类型的蛋白表达上,3个治疗组与模型组比较slow及fast蛋白含量逐渐升高,slow在高剂量组差异有统计学意义,P<0.01;fast在中高剂量组差异有统计学意义,分别为P<0.05及P<0.01。从肌萎缩相关蛋白的表达上看,与对照组比较,模型组MaFbx及MuRF1蛋白含量明显升高,差异有统计学意义,分别为P<0.01及P<0.001。3个治疗组与模型组比较MaFbx及MuRF1蛋白含量逐渐下降,MaFbx在中高剂量组差异有统计学意义,分别为P<0.01及P<0.001;MuRF1在高剂量组差异有统计学意义,P<0.01。Western blot方法测量各通路蛋白的表达,5个组中smad2/3含量均无明显变化。与对照组比较,模型组p-smad2/3蛋白含量明显升高,差异有统计学意义,P<0.001。3个治疗组与模型组比较p-smad2/3蛋白含量逐渐下降,在中高剂量组差异有统计学意义,分别P<0.01及P<0.001。5个组中akt含量均无明显变化。与对照组比较,模型组p-akt蛋白含量明显降低,差异有统计学意义,P<0.001。3个治疗组与模型组比较p-akt蛋白含量逐渐升高,在高剂量组差异有统计学意义,P<0.01。结论:1、长期烟雾暴露可以引起肺气肿,包括肺组织MAN的减少,MLI的增加,及肺功能的下降,同时引起骨骼肌重量的下降,肌肉力量下降,肌肉耐力可能受体重的影响,未明显下降,反而增加。腓肠肌横断面积减少,线粒体形态改变。myostatin及myogenin蛋白表达异常。2、红景天苷对COPD诱导的骨骼肌功能障碍发挥了保护作用,与剂量有一定的关系,其保护作用的机制与炎症介导的myostatin的表达降低以及myogenin的表达增加有关。3、红景天苷可以改善骨骼肌线粒体超微结构,使线粒体空泡变性减轻,能量代谢改善。红景天苷对骨骼肌纤维细胞的保护作用与抑制TGF-β-smad信号通路的激活,加强PI3K-akt信号通路的活化有关。