5-氨基乙酰丙酸(ALA)是所有生物体内卟啉化合物生物合成的关键前体,在农业生产上有着重要应用前景。然而,前人的研究主要以外源ALA为手段,迄今尚未有成功培育能够在自然条件下生长的过量合成ALA的转基因植物报道。本文以拟南芥HemAl启动子序列以及酿酒酵母菌Hem1基因序列为基础,构建了能够在光照条件下过量表达的重组基因,然后通过农杆菌介导,转化烟草、番茄、油菜和拟南芥,培育出能够生长在自然光照条件的过量合成ALA的转基因植株。利用这些转基因植株,研究了：YHeml基因转入对植物叶片光合特性、抗氧化酶活性、植物抗逆性、生物学与经济学产量的影响,并且运用基因芯片技术分析了转基因拟南芥植株表达图谱,对于明确ALA生理效应,阐明生理机制以及外源ALA在农业生产上推广应用具有一定指导意义。现将主要结果介绍如下。1.以拟南芥HemAl基因启动子和酿酒酵母ALA合酶基因(YHeml)为材料,构建植物双元表达载体,通过农杆菌介导法转入烟草品种’K326’中,获得转基因植株。以转基因烟草To代种子为材料,用不同浓度卡那霉素(Km)溶液浸种,结果显示,种子发芽率和子叶绿化率随着Km浓度升高而降低。将1000mg·L-1 Km处理的162株抗性植株移植至盆钵中培养,GUS检测出的阳性比率为92%。用特异引物PCR法检测Km抗性-GUS阳性植株,发现含有拟南芥HemAl基因启动子的比率为92.5%，含有酿酒酵母Heml基因的比率为88%,含有二价重组基因的比率为84.2%。荧光蛋白EGFP瞬时表达显示,YHeml编码蛋白定位在植物线粒体中。RT-PCR检测表明,YHeml基因在黑暗中的表达量明显低于光照下,证明光敏启动子有效地控制了结构基因：YHeml的表达。生理指标分析表明,与野生型相比,转基因植株ALA周转速率、叶绿素含量明显增加,叶绿素b/a比值提高。野生型植株基部叶片SPAD值显著降低,而转基因植株基部叶片SPAD值保持较高水平。以上结果说明,外源二价基因已经成功整合到烟草基因组中,编码蛋白分布于线粒体内,并且能够在光照条件下过量表达,合成过量ALA,并延长基部叶片衰老。2.转入：YHeml基因的烟草植株叶片具有更高的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)。叶绿素荧光动力学测定表明,转基因植株最大荧光(Fm)、可变荧光(Fc)、PS Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)等参数均显著提高,特别是下部叶片表现得更为明显。在光照下,转基因植株PS Ⅱ有效光化学效率(Fv’/Fm’)和实际光化学效率(Yield)、荧光猝灭系数(qP)、电子传递速率(ETR)、光化学效率(Pc)以及进入PS Ⅱ反应中心的能量(Pc+Ex)普遍高于野生型；同时,天线热耗散能量(Hd)以及非光化学荧光猝灭系数(NPQ)等明显低于野生型。这些差异在基部叶片中表现得尤为突出。PEA测定的φP。结果与PAM-2100得到的Fv/Fm结果高度一致,此外,转基因烟草叶片PIABS,和φE。明显高于野生型烟草叶片,同时Mo和Wk低于野生型,暗示转入YHeml基因可以提高烟草叶片的光合能力,有利于延长叶片光合寿命,提高光化学能量转换效应和光合产物积累。3.烟草植株叶片胆色素原含量相对稳定,而尿卟啉原Ⅲ、粪卟啉原Ⅲ、原卟啉IX、 Mg-卟啉Ⅸ、原叶绿素酸酯等在光照下含量下降,说明光照促进了卟啉化合物代谢。：YHeml基因转入后并不显著影响烟草叶绿素合成中间物含量,但是光照下转基因烟草叶片ALA合酶基因YHeml、ALA脱水酶基因Hem B、粪卟啉原Ⅲ氧化脱羧酶基因,Hem F、Mg-原卟啉Ⅸ甲基转移酶基因ChlM和叶绿素合酶基因ChlG表达量明显上调,说明ALA过量合成在基因表达水平上参与了植物叶片叶绿素合成过程。4.5-8月份烟草植株不同叶位叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定表明,POD活性与YHeml基因转入间有着更密切关系。同工酶谱分析表明,YHeml基因转入可以诱导烟草叶片产生新的POD同工酶。电镜观察表明,转基因烟草叶片叶绿体内含有更多的POD染色点。RT-PC R检测表明,转基因植株根系以及叶片抗氧化酶编码基因都有不同程度的表达上调。以上结果说明,YHeml基因转入烟草可以诱导植物抗氧化酶基因表达,提高酶活性,POD的变化最明显。并且与叶片超氧阴离子生成速率相关,也与叶片衰老程度有关。5.将YHem1基因通过农杆菌LBA4404介导转入番茄外植体中。经Km筛选和GUS染色,获得抗性再生植株。PCR和RT-PCR检测表明,YHeml已转入番茄基因组内,并且能够正常表达。转入酿酒酵母Hem1基因的烟草植株叶片能够在光照条件下过量合成ALA,并且含有更高水平的叶绿素含量。6.利用Li-6400型光合仪测定叶片气体交换参数,结果表明,转基因番茄净光合速率(Pn)比野生型增加55%,气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)也都显著增加。转基因番茄的表观光量子产量(AQY)为0.0363,而野生型为0.0313,两者差异达到显著水平,说明过量合成ALA可以提高番茄植株光能利用效率,促进光合产物积累。7.利用植物效率仪(PEA)研究不同饱和光强(90-2400 μmol·m-2·s-1)对番茄叶片快速叶绿素荧光诱导动力学的影响。结果表明,番茄叶片快速叶绿素荧光诱导动力学随着饱和脉冲光强的增加逐渐增加。叶片PS Ⅱ最大光化学效率(φPo)对饱和光强的反应不敏感,暗示φPo是一个比较稳定光合参数。捕获激子将电子传递到电子传递链QA下游其他电子受体的概率(Ψo)和PS Ⅱ反应中心吸收光能用于电子传递的量子产额(φEo)随着饱和光强的增加而降低,同时转基因番茄以吸收光能为基础的光合性能指数(PIABS)和以吸收面积为基础的光合性能指数(PICS)始终高于野生型番茄,说明过量合成ALA可以提高番茄叶片电子传递能力,增加了PSⅡ反应中心的活性,特别是电子传递受体侧活性。8.比较两种不同光强环境对转基因植株与野生型叶片快速叶绿素荧光特性日变化的影响,发现在弱光(最高光强80μmol·m-2·s-1)条件下OJIP曲线日变化存在一定差异,而在强光(最高光强1700μmol·m-2·s1)条件下OJIP差异显著增大,特别是在中午期间,最大荧光产额下降,并引起光合性能指数下降。由于两种环境下的温度是一致的,番茄叶片光合午休主要由中午强光引起。转基因番茄中午最大荧光产额显著高于野生型,光合性能指数也明显高于后者,说明ALA过量合成有利于减轻番茄叶片光合午休现象。9.将YHeml基因通过农杆菌LBA4404介导转入甘蓝型油菜外植体中,经PCR和RT-PCR检测表明,YHeml已转入油菜基因组内,并且能够在光暗条件调节表达。油菜开花期和结果期的生理指标分析表明,与野生型相比,转基因油菜叶片内源ALA周转速率、叶绿素含量等明显增加。利用便携式植物效率仪和JIP-test数据分析法研究表明,叶片光合性能指数(pIABS)、捕光性能(PTR)和传递电子性能(PET)等显著高于野生型植株叶片,叶片PSⅡ最大光化学效率(φPo、 PSⅡ反应中心吸收光能用于电子传递的量子产额(φEo)以及捕获激子将电子传递到电子传递链QA-下游其他电子受体的概率(Ψo)等,也明显高于野生型,而与反应中心关闭有关的荧光参数如Mo和Vj等均显著低于对照。过量合成ALA提高了油菜叶片单位受光面积有活性的反应中心数量(RC/CS)。盆栽植株产量表明,转基因植株比野生型增产80%左右,而对菜籽品质影响不明显。10.将YHeml基因通过蘸花法转化拟南芥,获得能在光照条件下过量表达YHeml基因的拟南芥植株。在转基因植株中,能够检测到ALA合酶活性,而野生型植株内没有ALAS活性。利用植物效率仪(PEA)测定两种基因叶片快速叶绿素荧光特性结果表明,转基因植株上与光合电子能量转化有关的荧光参数均高于野生型,而与非光化学能量耗散有关的荧光参数均低于野生型。另外,转基因植株的生物学积量显著高于野生型,说明ALA过量合成有利于植物光合积累和生物量提高。11.以转YHem1基因拟南芥为材料,研究不同浓度NaCl胁迫对种子萌发以及幼苗生长的影响,并分析了植株抗氧化酶活性以及相关基因表达的差异。结果表明,转入YHeml基因虽然没有明显提高植株内源ALA含量,但明显提高了ALA合成与代谢能力。在盐胁迫下,野生型种子萌发受到明显抑制,而转YHeml基因种子萌发率以及幼苗生长显著超过于野生型。YHem1基因转入或者盐胁迫都提高了拟南芥抗氧化酶包括SOD、POD、 CAT和APX活性,并且诱导相关编码基因表达水平的变化,降低了活性氧生成速率,减少了脂质过氧化产物丙二醛的积累。以上结果说明,YHeml基因转入有利于提高植物耐盐性,并且与抗氧化酶能力增强有关。12.采用Agilent拟南芥全基因组表达谱芯片(4×44K)检测了过量合成ALA转基因拟南芥和野生型拟南芥表达谱变化,采用SBC生物信息学在线分析系统(SAS系统)提供的Agilent GeneSpring GX分析软件以及NCBI、Refseq、 TIAR、 TIGR和Unigene等网上数据库,对芯片表达谱数据的差异基因筛选和注释,同时对通路分析和功能研究进行初步分析,共获得43604个拟南芥基因的差异表达图谱。与野生型相比,转YHeml基因植株共有16321个差异表达基因,其中上调基因9048,下调基因7273,这里包含着3651个上调至1.5倍或下调至0.5的基因。这些差异表达基因既有与信号途径有关的,也有与代谢途径有关,有转录因子,也有功能蛋白等。前期试验观察到的ALA对植物光合、呼吸、抗逆、延缓衰老等效应都可以从芯片表达谱中找到原因。