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研究背景炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease,IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s Disease,CD）,其中UC病变主要累及结肠黏膜及黏膜下层,以弥漫性、浅表性、反复复发和缓解为主要特征,临床症状主要表现为反复腹痛、腹泻以及黏液脓血便。目前5-氨基水杨酸（5-Aminosalicylic acid,5-ASA）、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等已被用来诱导治疗和维持缓解,但是目前仍然缺乏有效的方法来防止UC肠道炎症复发。UC在全球范围内的发病率呈逐年上升趋势,患者经济负担重、生活质量差,已成为全球公共卫生问题。UC发病与遗传易感性、免疫紊乱、微生物失衡、环境因素及肠粘膜屏障功能缺陷等多种因素相关。肠粘膜屏障作为机体和外界的第一道屏障,其功能紊乱与UC的发生及进展密切相关,但是其细胞和分子机制尚不完全清楚。因此,探索更有效的治疗方案和治疗靶点已成为目前面临的一大挑战。盘状结构域受体1（Discoidin domain receptor 1,DDR1）是跨膜受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase,RTK）超家族的成员,广泛表达于上皮细胞、纤维细胞、少突胶质细胞等。研究显示,DDR1的表达异常与炎症、纤维化、肿瘤等疾病密切相关。既往研究报道抑制DDR1表达可减轻大鼠局灶脑缺血后血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）的破坏,考虑到BBB和肠粘膜屏障功能、生理结构的相似性,我们提出假设:DDR1可能通过调节肠粘膜屏障功能参与UC的发生发展。目的探讨DDR1在肠粘膜屏障维护中的作用及可能的分子机制,为UC的治疗提供潜在靶点。方法1.Western blot检测活动期IBD患者、不同浓度葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium,DSS）诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠模型肠组织中DDR1的表达;2.DDR1基因敲除C57/BL6雄鼠(DDR1-/-)和野生型C57/BL6雄鼠（WT）分别诱导急性溃疡性结肠炎小鼠模型,于第8天麻醉后取眼球血、处死后取小鼠结肠、脾脏:（1）每日记录小鼠的一般情况、大便性状及直肠脱垂情况,每日记录小鼠体重及疾病活动性指数（Disease Activity Index,DAI）;（2）记录结肠长度,HE染色观察各组小鼠结肠结构变化;记录脾脏指数;（3）检测血清中FITC-dextran、D-LA、DAO评估肠粘膜屏障功能;（4）q RT-PCR检测各组小鼠结肠组织中炎性因子的表达;（5）TUNEL染色检测各组小鼠结肠组织凋亡水平;（6）western blot及q RT-PCR检测各组小鼠结肠组织中凋亡相关蛋白的表达;（7）western blot、q RT-PCR及免疫组化检测各组小鼠结肠组织中紧密连接（Tight Junction,TJ）蛋白的表达。3.体外培养HIEC和Caco2两株细胞系建立肠上皮细胞单层模拟肠粘膜屏障,利用慢病毒质粒PCDH-DDR1或p LKO.1-sh-DDR1–1分别构建过表达及敲减DDR1的细胞稳转株,炎性因子肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α）联合干扰素γ（Interferon gamma,IFN-γ）（T/I）干预细胞模拟UC肠粘膜屏障损伤,检测指标:（1）western blot验证HIEC和Caco2细胞DDR1表达水平,检测跨上皮电阻（Trans-epithelial electrical resistance,TEER）观察HIEC及Caco2细胞单层肠上皮屏障形成;（2）western blot及q RT-PCR验证两株细胞DDR1敲减及过表达效率,CCK8检测DDR1敲减及过表达对HIEC及Caco2细胞增殖的影响;（3）利用TEER和FITC-dextran检测DDR1对肠上皮单层屏障功能的影响;（4）q RT-PCR检测DDR1对肠上皮细胞表达炎性因子水平的影响;（5）流式细胞术检测DDR1对肠上皮细胞凋亡的影响;（6）western blot及q RT-PCR检测DDR1对肠上皮细胞单层屏障Bcl2/Bax凋亡轴的影响;（7）western blot及q RT-PCR检测DDR1对肠上皮细胞单层屏障TJ蛋白的影响;（8）western blot检测DDR1对NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路相关蛋白的影响;（9）NF-κB抑制剂JSH-23提前预处理细胞,western blot检测T/I诱导下各组细胞NF-κB-MLCK-p-MLC2相关通路蛋白及TJ蛋白表达的变化。结果1.DDR1在活动期CD和UC患者结肠炎症组织中的表达明显低于非炎症组织,DDR1在DSS诱导的急性实验性结肠炎肠组织中表达降低,且呈现动态降低;DDR1在DSS诱导的慢性实验性结肠炎肠组织中表达升高;2.通过CRISPR/Cas9构建的DDR1基因敲除雄鼠(DDR1-/-)大体和WT雄鼠相似,正常状态下不影响小鼠肠道的形态、结构和通透性。予以4%DSS构建急性溃疡性结肠炎小鼠模型,与DSS（WT）小鼠相比:（1）DSS(DDR1-/-)组小鼠体重下降减轻、DAI评分下降;（2）DSS(DDR1-/-)组小鼠结肠长度缩短不明显、HE示结构紊乱较轻、上皮层细胞损伤较轻、脾脏指数较低;（3）DSS(DDR1-/-)组小鼠血清FITC-dextran、D-LA、DAO水平明显降低;（4）DSS(DDR1-/-)组小鼠结肠组织炎性因子水平更低;（5）DSS(DDR1-/-)组结肠组织TUNEL染色凋亡荧光信号明显减少;（6）DSS(DDR1-/-)组小鼠结肠组织中Bcl2表达明显升高,Bax、Cleaved-caspase3表达明显降低;（7）DSS(DDR1-/-)组小鼠结肠组织中TJ蛋白ZO-1和Occludin表达明显升高。3.（1）HIEC和Caco2细胞稳定表达DDR1,HIEC和Caco2细胞在单层屏障形成过程中,电阻值逐渐增加,HIEC细胞电阻值于9-10天趋于稳定,Caco2细胞于19-21天趋于稳定;（2）成功构建敲减及过表达DDR1的HIEC和Caco2稳转株,敲减DDR1能够减缓HIEC和Caco2细胞的生长,过表达DDR1能够促进HIEC和Caco2细胞的生长;未经炎性因子T/I刺激,DDR1敲减及过表达不影响单层肠上皮屏障的功能;（3）DDR1敲减能抑制炎性因子诱导的TEER的降低,明显降低FITC-dextran透过单层的量,DDR1过表达能明显促进炎性因子诱导的TEER的降低,增加FITC-dextran透过单层的量;（4）DDR1敲减明显降低了炎性环境下炎性因子的表达,DDR1过表达明显升高了炎性环境下炎性因子的表达;（5）DDR1敲减明显抑制了炎性因子T/I导致的细胞凋亡,DDR1过表达明显促进了炎性因子诱导的细胞凋亡;（6）DDR1敲减能明显抑制炎性因子诱导的Bcl2/Bax的激活,而DDR1过表达促进了凋亡轴Bcl2/Bax的激活;（7）DDR1敲减能明显抑制炎性因子导致的ZO-1和Occludin降低,DDR1过表达能明显促进炎性因子导致的ZO-1和Occludin降低;（8）DDR1敲减明显抑制了NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路的激活,相反的,DDR1过表达促进了NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路的激活;（9）在NF-κB信号通路抑制剂JSH-23预处理,再经T/I刺激后,NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路活化程度明显降低,但是DDR1敲减在一定程度上还是能抑制NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路的激活,并抑制了TJ蛋白的降低,而DDR1过表达促进了NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路的激活,并促进了TJ蛋白ZO-1、Occludin的降解。结论1.DDR1在急性结肠炎中表达降低,在慢性结肠炎中表达升高;2.DDR1基因敲除缓解了急性实验性结肠炎的进展,减轻了肠粘膜屏障损伤;3.DDR1通过促进肠上皮细胞凋亡和TJ蛋白降解加重肠粘膜屏障损伤;4.DDR1通过调节NF-κB-MLCK-p-MLC2信号通路调节肠粘膜屏障损伤。