味觉与人们的日常生活息息相关,而苦味是5种基本味觉之一。苦味受体是G蛋白偶联受体,其胞内信号途径为典型的钙离子信号途径：苦味受体(G蛋白偶联受体)→膜内G蛋白→磷脂酶C→肌醇三磷酸。苦味感知对人和动物而言,在生理意义上具有识别有害物质的作用。大多数情况下,苦味化合物都会引起一定程度的厌食甚至反胃呕吐,这直接导致了很多含苦味成分的食品药品顺应性的下降,尤其对于儿童及老人用药。因此在产品的研发过程中,经常需要进行苦味强度测试,这就需要用到苦味评价技术。经文献调研发现,一些小分子(无味)的加入可以使苦味溶液的苦味强度降低。本论文认为,对于一些常见的小分子,如氨基酸,最大的掩味途径应该是与苦味化合物在水溶液中发生了一定的相互作用,从而引起苦味强度下降。对此,本论文选用苯甲地那铵与对乙酰氨基酚两种典型苦味化合物以及系列氨基酸,对它们的混合水溶液进行拉曼光谱及氢谱核磁共振研究,以表征可能存在的分子间相互作用。实验结果显示,两种碱性氨基酸与苦味化合物间的核磁共振图谱与各自纯溶液的图谱相比,出现了一定的位移现象,提示可能存在相互作用现象。在此基础上,本论文采用了人尝味法和动物尝味法对这几种化合物组合进行苦味淬灭效果的评价。目前常用的评价技术基本可以涵括为4种：人尝味法、动物尝味法、苦味表达细胞—钙成像法及电子舌法。人尝味法与动物尝味法对设备要求不高,但是在实际应用中误差较大；电子舌具有快速安全的特点,其准确性依赖电极、处理方法及校准溶液的合理选择。但是电子舌系统造价昂贵、维护困难,课题组并不具备使用电子舌的条件。基于上述情况,本论文对苦味受体表达细胞—钙成像模型进行了构建。综合考虑25种人苦味受体及其配体,TAS2R39的配体包括对乙酰氨基酚、奎宁、维生素B等常见的苦味物质,可以给本论文往后的实验提供较大的选择性。除了TAS2R39受体以外,根据钙离子信号通路,还需要对外源细胞转染相应的Ga蛋白,以实现苦味信号的感知。综上所述,本论文进行了以下实验：两种蛋白质粒的构建、扩增与鉴别、细胞转染及稳定表达株筛选、钙成像。经过对实验步骤、条件及试剂的筛选,对于两种蛋白目前都已经能够获得70%以上的较高的转染效率,并进行了初步的钙成像实验。如果能够直接利用苦味受体结合苦味化合物,通过光谱或其他标记物进行表征,将比钙成像法来的更简便直接。本论文使用膜蛋白提取方法对猪平滑肌细胞中的苦味受体进行了提取、定量,并设计了系列荧光实验,利用具有自身荧光的苦味物质作为标记,将平滑肌提取蛋白与其他组织提取蛋白进行苦味化合物选择性结合能力的比较。在实验中,蛋白质浓度—吸收标准曲线的相关系数达到98.3%；苦味化合物盐酸奎宁在线性范围内的浓度—荧光标准曲线相关系数达到98.2%。而且盐酸奎宁的荧光稳定比较好,6h后荧光值下降到最大值的80%就不再下降。在苦味受体的选择性结合实验中,发现平滑肌蛋白的苦味化合物结合能力要明显优于其他组织蛋白的结合能力。但是也发现热变性平滑肌蛋白同样具有一定的选择性结合能力。