大肠杆菌是人和动物肠道内常见的革兰氏阴性短杆菌,可以条件性引起人和动物发病,是一种具有重要公共卫生意义的动物源性的病原菌。尽管大肠杆菌感染不同宿主以及长时间在环境中滞留的原因有很多,但是作为一种可以产生物被膜的细菌,其产膜的特性可以帮助自身适应宿主以及非宿主环境。生物被膜的形成会导致细菌的生理代谢产生很大的变化,使得细菌适应性增强,例如抵抗外界恶劣环境的能力增强等。到目前为止,关于质粒介导生物被膜的形成相关基因鲜有报道。本实验在前期工作中分离到一株广泛流行的耐药大肠杆菌,通过接合转移试验发现,该菌株携带的可接合性质粒不仅含有多个耐药基因,而且能介导宿主菌产生较强的生物被膜。本研究拟以该质粒的接合子C600-253为研究对象,通过转座子随机插入突变的方法,构建大肠杆菌突变文库,从而筛选与大肠杆菌生物被膜形成有关的基因。本研究将EZ-Tn5转座复合物通过电转化,随机插入含有质粒253的大肠杆菌中细菌染色体和质粒基因上,借助转座元件携带的抗性基因,在抗性平板上获得30000株突变子。借助试管壁成膜观察以及结晶紫染色的方法,从3000株突变子中筛选到28株成膜能力下降的突变子,进一步通过两轮半任意PCR技术鉴定插入位点侧翼序列,鉴定发现28株中有24株为染色体基因插入突变,这些基因主要参与鞭毛、菌毛的合成、参与多糖合成,参与能量生成与转化,以及调控基因过程。部分基因已经被报道与生物被膜形成有关,剩余基因与生物被膜的关系有待进一步探究。28株突变子中有4株突变子经Southern杂交等方法验证,其插入位点为253质粒,将插入序列与接合子二代测序结果对比,这4株刚好插入在同一段NODE序列上,而且插入基因的起始来源都是阴沟肠杆菌染色体基因,分析该段NODE序列,发现该段序列基因组成很特殊,两端分别是反向重复的插入序列IS1,中间有两段基因来源于柠檬酸菌和阴沟肠杆菌,总长7949 bp。4株突变子均插入在来自阴沟肠杆菌处区域,该处基因为菌毛基因簇。为检测该段基因与生物被膜形成关系,将整段NODE序列以及序列中的部分基因fimA、fimC、fimA+fimC分别亚克隆到质粒载体上,转化至DH5α中,检测到含有整段NODE序列的克隆株,成膜能力极强,其他单基因克隆无成膜能力,说明253质粒上这段来自阴沟肠杆菌的菌毛基因簇是引起大肠杆菌生成生物被膜的决定性因素。当前的研究中,借助EZ-Tn5转座复合物构建了饱和的大肠杆菌转座子随机突变库,并成功寻找出质粒上引起生物被膜形成的决定性基因。我们还发现成膜基因由移动元件IS1携带,来源于阴沟肠杆菌染色体并转移到大肠杆菌质粒上,再由质粒介导进入到大肠杆菌中进行表达,引起强烈生物被膜表型。