研究背景及目的牙周病是全世界范围内高发的口腔疾病,是成年人缺失牙的首要病因,严重影响患者的口颌系统功能和心理健康。其作为一种慢性感染源持续性存在于体内,会引起机体的长期的免疫反应,与全身多种系统疾病密切相关。目前临床应用的传统牙周治疗包括洁治、刮治、根面平整等等,效果只限于减慢或阻止局部炎症的发展和病损组织的进一步破坏,并未能达到令人满意的牙周组织的修复和再生。对患者牙周疾病的治疗受到临床医师的广泛重视,寻找新的、有效的、稳定的牙周病的治疗方法也一直是临床医师和科研工作者的努力目标。为研究治疗牙周组织缺损,近年来有学者创新性地将另一学科技术引入口腔医学,即组织工程学,利用其学科技术优势来修复牙周部位的缺损组织,即牙周组织工程技术。目前公认的组织工程技术的三大要点,一是种子细胞,二是支架材料,最后一个关键点是生长因子。首先如何筛选并研究性能良好的种子细胞发挥其细胞特性优势应用于缺损处为组织工程研究的重中之重。而干细胞因其较其他种类细胞所具有的天然的多向分化潜力目前是最多用于研究的种子细胞。成体干细胞具有来源广泛、易于获取、不涉及伦理问题且同样具备较强增殖能力和多向分化潜能引起学者广泛的研究兴趣。作为成体干细胞,人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）是从口腔牙齿根尖周围组织中可培养获取的一种干细胞,其具有干细胞最典型特征:可以向多种方向分化,同时增殖能力极强,在组织工程领域已有广泛应用,而且近年来关于其的各方面研究越来越得到关注。如何调控好hPDLSCs的成骨分化并将其有效应用于牙周组织工程领域是学者的研究热点。作为组织工程中三大关键因素之一,生长因子存在成本高、稳定性差、半衰期短、剂量相关不良反应等诸多缺点。小分子化合物通常结构相对简单,易于制备且成本较低,并具有多种生物学功能。因此天然及合成来源的小分子是生长因子的潜在的替代品,开发和研究能够替代生长因子并可调控hPDLSCs自我更新和多项分化潜能的小分子化合物是牙周组织再生的一个重要思路。白藜芦醇（Resrveratrol,RSV）是一种被日本学者首次发现从多种植物中提取获得的小分子,不仅大量存在于葡萄皮中,在花生、蓝莓等其他70多种植物中也有发现,作为一种植物抗毒素,在植物遭受紫外线照射、真菌感染等不良刺激时产生,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、心血管保护等治疗多种疾病的潜能。此外,RSV具有植物雌激素功能,能促进多种干细胞成骨分化和血管形成,但RSV是否影响hPDLSCs的成骨分化及潜在的机制并不清楚。广义层面上,全转录组涵盖了特定状态下某种细胞内所有的RNA分子,不仅包括了常见的已被大量研究的可以体内行使功能的信使RNA（messenger RNA,mRNA）,也包括近年来开始逐渐被发现和探究的非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）。明显区别于已被广泛探索的mRNA,ncRNA被发现不拥有编码蛋白质的特性,除在基因水平之外,也在染色体水平参与基因的调控表达。依据碱基的数目大小不同,ncRNA被研究者们分类成短链RNA,如微小RNA（microRNA,miRNA）,和多于200个碱基的长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）。伴随RNA研究方法的改善,学者们近年来在诸多非编码RNA中又辨识出不具备线性结构而是环状结构的新型RNA,即环型 RNA（circular RNA,circRNA）。目前单一的mRNA或ncRNA研究已远远难以达到学者的科研需求。借助高通量测序技术,人们可以获取样本中全部的转录产物信息（包括mRNA、miRNA、lncRNA 及 circRNA）,并结合竞争性内源 RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）机制,进行联合分析,深入挖掘转录水平调控网络的机制。基于以上背景,本课题设计了如下实验,以探究RSV对hPDLSCs成骨分化的影响及潜在分子机制。本实验首先分离培养了 hPDLSCs,检测了不同浓度RSV对hPDLSCs的增殖、凋亡、克隆形成、迁移、成骨、成脂等多种生物学行为的影响,筛选出适合进一步研究的RSV的浓度为1μM。其次,检测了 RSV（1μM）对hPDLSCs的成骨相关基因和蛋白表达的影响,初探了 RSV（1μM）对hPDLSCs的成骨分化过程中细胞内丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）（ERK1/2、p38）通路的改变情况。再次,我们建立了大鼠下颌骨缺损模型,通过体内实验评估了 RSV的促缺损区骨修复的能力。最后,对RSV促hPDLSCs成骨分化所涉及的全转录组（mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）的表达谱进行检测,结合ceRNA机制进行联合分析,筛选可能的核心靶点,初探RSV促hPDLSCs成骨分化的调控机制。方法1.从人牙周膜组织中分离培养hPDLSCs,并绘制生长曲线;采用流式细胞仪检测其免疫表型;采用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红（Alizarin Red S,ARS）染色、油红O染色检测细胞是否具有成骨、成脂多项分化潜能;采用细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷试剂盒（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）和凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI）检测 RSV（0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM）对hPDLSCs增殖和凋亡的影响;采用平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验检测RSV（0.1μM、1μM、10μM）对hPDLSCs克隆形成能力和迁移能力的影响;采用ALP染色和活性试剂盒、ARS、油红O检测RSV（0.1μM、1μM、10μM）对hPDLSCs成骨、成脂分化的影响。2.采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测 RSV（1μM）对hPDLSCs的成骨分化标志物的基因和蛋白表达的影响;采用WB检测RSV对hPDLSCs中MAPK（ERK1/2、p38）通路的激活情况;采用WB检测PD98059、SB203580对RSV引起MAPK（ERK1/2、p38）激活的抑制情况;采用CCK-8法检测PD98059、SB203580对RSV影响hPDLSCs增殖的改变;采用ALP染色及活性试剂盒检测PD98059、SB203580对RSV促hPDLSCs成骨分化的影响;采用ARS染色及钙结节定量检测D98059、SB203580对RSV促hPDLSCs成骨分化的矿化结节形成的影响;采用WB和qRT-PCR检测PD98059、SB203580对RSV促进hPDLSCs成骨标志蛋白和基因表达的影响。3.沉淀法制备hPDLSCs+脱细胞真皮基质（Acellular Dermal Matrix,ADM）膜复合物;扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察 ADM 膜及hPDLSCs附着情况;构建大鼠下颌骨缺损模型,缺损区分4组（空白对照组、ADM膜组、ADM+hPDLSCs组、ADM+RSV+hPDLSCs组）分别植入对应材料,饲养大鼠4w后处死;Micro-CT扫描各组缺损区,并进行三维重建,统计分析实验各组骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁分离度、骨小梁厚度;标本脱钙之后,制作石蜡切片,对实验各组进行苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）;Masson 染色、免疫组化（Immunohistonchemistry,IHC）染色。4.对加入或不加RSV的hPDLSCs进行成骨诱导7天（day,d）,在第7d时收集细胞提取RNA,委托联川生物技术股份有限公司进行RNA质检、制备文库、测序,检测RSV加入前后hPDLSCs成骨分化过程中mRNAs、miRNAs、lncRNAs和circRNAs的表达谱的变化。依据常规设定的两个筛选标准,利用生物信息学技术,以|log2Foldchange|≥1且P值＜0.05筛选差异表达明显的mRNAs（DifferentiallyexpressedmRNAs,DEGs）、差异表达的 miRNAs（Differentially expressed miRNAs,DEMs）、差异表达的 lncRNAs（Differentially expressed lncRNAs,DELs）和差异表达的 circRNAs（Differentially expressed circRNAs,DECs）,并进行聚类分析。采用qRT-PCR验证测序结果的可靠性;对DEGs、DEMs靶基因,DELs的靶基因DECs的亲本基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）、京都百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析;cytoscape 软件绘制 miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA、circRNA-miRNA 联合分析图。最后,筛选词条 GO:0001649（osteoblast differentiation）所涉及的ceRNA,应用cytoscape软件进行可视化做图,预测调控成骨分化的关键的mRNAs、miRNAs、lncRNAs及circRNAs。结果1.从人牙周膜组织中成功获取了 hPDLSCs,经鉴定其具有间充质干细胞特性和多项分化潜能（可成骨分化、成脂分化）。高浓度的RSV（20μM、50μM、100μM）可明显抑制hPDLSCs细胞活性、增殖能力,促进细胞凋亡。低浓度范围内RSV（0.1μM、1μM、10μM）可显著促进hPDLSCs细胞活性、增殖能力和克隆形成能力,但抑制细胞迁移,对细胞凋亡无影响。此外,RSV（0.1μM、1μM、10μM）明显加深成骨诱导环境下hPDLSCs的ALP染色、增加ALP活性、增加钙结节,同时可以抑制hPDLSCs成脂向分化。2.1μM的RSV显著促进了诱导了 7d、14d、21d的hPDLSCs成骨相关标志物基因和蛋白的表达水平。1μM的RSV激活了 MAPK通路中的ERK1/2和p38信号通路。两通路对应的抑制剂分别的加入可明显抑制RSV的促hPDLSCs的增殖的作用,且ALP染色变浅、ALP活性降低、矿化结节减少、成骨相关标志物基因和蛋白表达水平降低。3.Micro-CT扫描发现RSV预处理hPDLSC组新生骨的各项指标中,不仅骨体积分数有所增加、另外两项骨参数指标明显优于其他各组,而只有骨小梁分离度却显著低于其他各组。HE染色发现RSV预处理hPDLSC组新骨形成量最高。Masson染色表明相比空白对照组,其余3组的骨成熟比例较高。CD31的IHC染色结果提示RSV预处理hPDLSC组新生血管最多,而且骨缺损区Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）的蛋白表达量明显优于其他3组。4.高通量测序检测RSV对hPDLSCs成骨分化过程中全转录组表达谱的影响,根据筛选标准发现589个上调mRNAs,119个下调mRNAs;68个上调的miRNAs,66个下调miRNAs;45个上调lncRNAs,23个下调lncRNAs;22个上调circRNAs,55个下调circRNAs。根据成骨分化词条GO:0001649筛选,并构建ceRNA 网络,可得 7个 mRNAs、41 个miRNAs、30个 lncRNAs、27个circRNAs与成骨分化密切相关。结论1.本实验成功分离获取hPDLSCs。高浓度RSV可明显抑制hPDLSCs细胞活性、增殖能力,促进细胞凋亡。低浓度范围内RSV可显著促进hPDLSCs细胞活性、增殖能力和克隆形成能力,但抑制细胞迁移,不影响细胞凋亡。低浓度RSV可促进hPDLSCs的成骨分化而抑制hPDLSCs成脂分化。2.1μM的RSV显著促进了hPDLSCs成骨诱导过程中成骨标志基因、蛋白的表达,并通过激活MAPK中的ERK1/2和p38两条平行通路来促进hPDLSCs的增殖和成骨分化。3.成功构建大鼠下颌骨缺损模型,并发现负载RSV预处理hPDLSC的ADM膜组的新骨形成能力最强,证实了RSV的体内的促骨缺损区的修复能力。4.RSV改变了hPDLSCs成骨分化过程中mRNAs、miRNAs、lncRNAs、circRNAs的表达谱。其中根据成骨分化词条筛选可得7个mRNAs、41个miRNAs、30个lncRNAs、27个circRNAs与成骨分化密切相关,这些为可进一步深入研究的RSV调控hPDLSCs成骨分化的关键靶点。