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十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)又名蓝氏贾第虫(G.lamblia)(简称贾第虫),是一种重要的人兽共患原虫,寄生在宿主十二指肠,主要引起腹泻。贾第虫可通过水源传播,我国城市供水水质和生活饮用水卫生标准均把贾第虫检测列为必检项目。目前治疗贾第虫病常用药物有甲硝唑、替硝唑等,药物副作用较大且虫体已产生耐药性。由于尚没有预防贾第虫病的疫苗,因此贾第虫病仍然是严重危害人畜健康的一种原虫病。天然免疫是机体抵抗病原的第一道防线,目前宿主天然免疫在抗贾第虫感染中的作用尚不明确,深入开展宿主天然免疫防御贾第虫研究将为该病防治提供理论依据。胞外陷阱(Extracellular Traps,ETs)是机体抵抗病原的一种重要天然免疫方式。当嗜中性粒细胞、巨噬细胞等受到外界病原或某些化学物质刺激后,向细胞外释放出主要以DNA为骨架并附着有颗粒蛋白的纤维网状结构,该结构可对多种胞外病原微生物进行捕获和杀灭。贾第虫是一种胞外寄生原虫,目前贾第虫能否诱导巨噬细胞ETs(METs)以及该METs对贾第虫是否具有捕获和杀伤作用尚不清楚。本研究对贾第虫诱导巨噬细胞ETs形成及METs对贾第虫的杀伤作用等进行了研究,以期确定胞外陷阱在防御贾第虫中的作用。主要的研究内容和结果如下:贾第虫滋养体诱导巨噬细胞胞外陷阱形成及其成份鉴定首先分离小鼠腹腔原代巨噬细胞,通过检测巨噬细胞特异性表达的CD11b蛋白确定纯度。为了确定小鼠腹腔原代巨噬细胞释放胞外陷阱的能力,用PMA、Zymosan、LPS作用巨噬细胞后,经核酸染料Hoechst 33342和Sytox Orange染色后激光共聚焦显微镜观察胞外DNA释放情况。结果表明分离的小鼠腹腔原代巨噬细胞纯度可达95%,PMA、Zymosan、LPS作用小鼠腹腔原代巨噬细胞后观察到胞外网状DNA。说明小鼠腹腔原代巨噬细胞具备释放ETs的能力。贾第虫滋养体(活虫和死虫)刺激巨噬细胞后,通过扫描电镜观察胞外网状结构。经Sytox Orange、组蛋白3抗体和髓过氧化物酶抗体分别处理后激光共聚焦显微镜观察胞外网状DNA释放情况及组成。结果表明贾第虫滋养体(活虫和死虫)均诱导巨噬细胞产生胞外网状结构,主要成份为DNA、组蛋白3以及髓过氧化物酶。说明贾第虫滋养体能够诱导巨噬细胞产生ETs。p38、ERK通路、MPO、Ca2+(SOCE)、NADPH oxidase在贾第虫诱导METs释放中的作用贾第虫滋养体分别刺激p38抑制剂SB202190、ERK抑制剂UO126预处理的巨噬细胞和正常巨噬细胞后,通过western blot检测p38和ERK的磷酸化。贾第虫滋养体分别刺激p38、ERK、MPO、Ca2+(SOCE)、NADPH oxidase抑制剂预处理的巨噬细胞和正常巨噬细胞后,用核酸染料Sytox Green染色并通过荧光酶标仪检测胞外DNA释放情况。结果表明贾第虫滋养体能够引起巨噬细胞p38和ERK蛋白的磷酸化,SB202190和UO126p38抑制贾第虫诱导的巨噬细胞p38和ERK的磷酸化。p38、ERK、MPO、Ca2+(SOCE)、NADPH oxidase抑制剂处理后贾第虫滋养体诱导的胞外DNA释放量显著降低(P<0.05)。说明p38、ERK通路以及MPO、SOCE、NADPH oxidase在贾第虫诱导的METs形成过程中发挥一定的作用。贾第虫滋养体诱导METs过程中胞内活性氧簇产生及胞外乳酸脱氢酶释放的测定为了确定贾第虫引起的METs是否依赖活性氧簇的爆发,用荧光探针DCFH-DA对细胞内活性氧簇进行了检测。为了研究贾第虫滋养体诱导METs产生的过程中巨噬细胞是否发生了坏死,使用乳酸脱氢酶释放法检测贾第虫滋养体引发的细胞乳酸脱氢酶释放情况。结果表明贾第虫刺激可增加胞内活性氧簇产生量(P<0.05)。贾第虫刺激组与正常细胞组相比乳酸脱氢酶水平无显著差异(P>0.05)。说明贾第虫诱导METs形成的过程中细胞并未发生坏死。METs对贾第虫滋养体的体外杀伤作用检测为排除巨噬细胞吞噬作用的干扰,加入细胞松弛素D阻断巨噬细胞吞噬作用后,通过间接荧光的方法检测贾第虫引发的胞外DNA释放量。用台盼蓝染色法检测METs捕获作用对贾第虫滋养体影响,通过扫描电子显微镜观察经METs捕获后的虫体形态的超微结构变化。结果表明细胞松弛素D不影响贾第虫滋养体诱导METs的释放,而METs作用4h后滋养体存活率与对照组相比下降为68.25%,虫体主要病变为腹吸盘表面的细胞膜出现破损,其他表膜出现不同程度的皱缩。表明METs对贾第虫滋养体有一定的杀伤作用。综上所述,本研究确定贾第虫能够诱导巨噬细胞释放ETs,METs对贾第虫滋养体有一定的杀伤作用。表明胞外陷阱是机体抵抗贾第虫的一种免疫应答方式。