临床研究和动物实验证明,饮酒不仅可以导致中枢神经系统的损伤,而且还会引起周围神经病变。长期以来,酒精对中枢神经系统影响作用的研究较为深入,而对酒精性周围神经病变的研究不够深入,其神经病理作用机制目前仍不清楚。最近研究结果表明,酒精导致的神经元死亡与氧化应激反应增加和氧化酶的诱导相关。长期大量饮酒可导致酒精性周围神经病变(alcoholic peripheral neuropathy, APN)。APN是最常见的多发性周围神经病变之一。APN初期和主要症状为足部的疼痛,部分疼痛伴有烧灼感。部分患者亦可表现为手、小腿和足部的麻木或感觉缺失。APN的病理变化主要表现为轴突的病变,伴有节段性的脱髓鞘和髓鞘再生以及神经纤维的减少。虽然具体发病机制尚不清楚,但目前研究认为APN与氧化应激导致的自由基对神经的损伤、酒精对神经的直接毒性作用和长期饮酒导致的胶质细胞活化有关。施万细胞(Schwann cells, SCs)是周围神经系统的髓鞘形成细胞,对周围神经的发育、功能和再生具有重要作用。SCs在多种炎症性、代谢性和遗传性多发神经病变中也有着重要作用。在许多生理和病理状态下,尤其是在神经损伤后,SCs可以通过表达脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)等多种神经营养因子对轴突提供营养支持。SCs分泌的神经营养因子对于促进轴突生长、预防神经元凋亡具有重要作用。然而,在酒精处理的培养的SCs中,神经营养因子表达的变化尚不清楚。白藜芦醇(resveratrol, Res)是存在于红酒、葡萄、蓝莓、花生等多种植物中的多醇化合物,可以调节多种细胞进程,并显示出多种保护和治疗功效。在Neuro2a细胞,Res能够激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)并促进轴突的生长。Res能够激活沉默信息调节器T1(silencing information regulator T1, SIRT1),可能对以轴突病变和神经退行性变为特征的疾病具有治疗作用。Res能够增强细胞的抗氧化反应能力,对某些病理改变所致的背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)神经元氧化应激损伤具有修复作用。为了进一步深入研究APN的病理发生机制,以及如何阻止APN的进程和研发APN的新的治疗手段,本课题利用体外培养的DRG神经元和SCs、以及APN大鼠动物模型,通过对多个分子生物学和生物化学指标的分析,以及动物的行为学观察,进一步探讨APN的病理发生机制及Res对APN的治疗作用。第一部分白藜芦醇对酒精损伤的背根神经节神经元的保护作用在发育过程中,神经嵴区的细胞迁移形成DRG。全胚胎培养研究证明酒精可导致神经嵴区的细胞减少。酒精还可导致培养的孕14d胚胎DRG神经干细胞凋亡增加。抗氧化治疗对酒精诱导的神经损伤具有保护作用,这也表明氧化应激参与酒精导致的神经损伤。但是,尚不清楚抗氧化剂能否有效减少在发育过程中酒精诱导的神经元减少。由于酒精对DRG神经元的损伤目前尚无有效的治疗方法,抗氧化剂有可能减轻酒精导致的神经损伤。本课题利用体外培养的DRG神经元,研究体外环境中Res对酒精损伤的DRG神经元的保护作用。基于以上研究背景,本课题实验设计如下：取第15d的胚胎大鼠DRG进行器官型培养和分散细胞培养。将酒精、Res、化合物C(Compound C,CC)以及尼克酰胺(nicotinamide,NCA)分别加入不同实验组DRG神经元培养基内。用微管相关蛋白2(microtubule-associatedprotein2,MAP2)标记神经元。计数由器官型培养的DRG组织块中生长出的神经纤维束和迁移出的神经元的数目。使用水溶性四唑盐-1(water soluble tetrazolium salt-1, WST-1)的方法检测DRG神经元的活性。使用Hoechst33342和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end-labeling, TUNEL)染色技术观察神经元的凋亡。使用荧光探针2’,7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)检测活性氧的含量。检测神经元中丙二醛(malondialdehyde, MDA),谷胱甘肽(glutathione, GSH),亚硝酸盐和过氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平来分析氧化应激的程度。结果显示：(1)Res可促进酒精损伤的器官型培养的DRG组织块神经纤维束的生长和单个神经元向周围的迁移。AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂NCA可以抑制Res的作用。(2)酒精孵育可降低分散培养的DRG神经元的活性,给予Res可提高酒精损伤的DRG神经元活性。AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂NCA可以抑制Res的作用。(3)酒精孵育可诱发分散培养的DRG神经元凋亡,Res可改善酒精诱发的DRG神经元凋亡。AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂NCA可以阻断Res的抗凋亡作用。(4)酒精孵育可增强分散培养的DRG神经元的氧化应激,应用Res可抑制酒精所致的氧化应激,降低MDA和亚硝酸盐的水平,增加GSH的含量和SOD的活性。以上结果表明,Res对酒精损伤的器官型培养的DRG神经元的生长和再生具有促进作用；Res可增强酒精损伤的分散培养的DRG神经元的活性；Res可改善酒精损伤所致的DRG神经元凋亡和氧化应激；Res的神经保护作用与其对AMPK和SIRT1的激活有关,也与其抗氧化作用有关。因此,增强AMPK和SIRT1的活性有可能成为酒精对初级感觉神经元损伤的一种新的治疗方法,Res对DRG神经元的保护作用很可能使Res成为通过这一途径治疗酒精所致感觉神经元损伤的一个重要候选因子第二部分白藜芦醇对酒精损伤的施万细胞的保护作用SCs对DRG神经元正常形态和功能的维持具有重要的作用,酒精所致的DRG神经元损伤,很可能不但直接作用于神经元,也可能对SCs造成损伤从而间接影响DRG神经元功能的发挥。有研究显示,酒精可抑制培养的SCs增殖和髓鞘的形成,孕期和哺乳期长期大量饮酒可导致胶质细胞BDNF和NGF表达的改变,可能会损伤细胞内与细胞成活、生长、分化相关的信号通路,增加脑发育过程中细胞的死亡。然而,酒精对SCs的损伤程度及Res是否对酒精损伤的SCs具有保护作用目前仍不清楚。因此,本课题设计如下实验,研究Res对酒精损伤的SCs细胞的保护作用。取新生大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经进行SCs培养。培养的细胞分为6组：Res+酒精组；Res+CC+酒精组；Res+NCA+酒精组；Res+CC+NCA+酒精组；酒精组；对照组。用WST-1分析法检测Res对酒精引起的SCs细胞增殖和毒性的影响,用Hoechst33342和TUNEL染色技术观察SCs细胞的凋亡用实时荧光定量PCR技术检测BDNF.GDNF和NGF mRNA表达的变化,用Western blot技术检测BDNF.GDNF和NGF蛋白表达的变化。结果显示：(1)酒精可降低SCs细胞的活性,Res可改善酒精损伤的SCs细胞的活性。AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂NCA可以阻断Res的作用。(2)酒精孵育可增加SCs细胞的凋亡,Res可抑制酒精引起的细胞凋亡。AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂NCA可以阻断Res的抗凋亡作用。(3)酒精孵育可促进SCs细胞NGF mRNA的表达,而对BDNF mRNA和GDNF mRNA的表达无显著影响作用；Res孵育可促进SCs细胞BDNF mRNA和GDNF mRNA的表达,而对NGF mRNA的表达无显著影响作用。(4)酒精孵育可促进SCs细胞NGF、BDNF和GDNF蛋白的表达,而Res则可促进BDNF和GDNF的表达,对NGF的表达反而具有抑制作用。以上结果表明,Res对酒精损伤的SCs细胞具有保护作用,Res很可能通过调节神经营养因子的表达而减少细胞的凋亡,从而发挥保护作用。Res对不同的神经营养因子的表达具有不同的调节作用,这表明Res对神经营养因子的表达的调节作用是复杂的。酒精孵育对SCs细胞不同神经营养因子表达产生不同的影响,这表明SCs细胞对所用酒精剂量的反应性,很可能是细胞的一种自我保护机制。酒精对SCs细胞的毒性作用机制及Res对SCs细胞的保护作用及其机制尚有待于进一步探讨。第三部分白藜芦醇对大鼠酒精性周围神经病变的保护作用氧化应激是导致周围神经病变出现神经痛的重要因素之一。细胞因子可直接与伤害感受器作用并引起炎症反应,导致痛觉过敏。Res可通过清除ROS并作用于氧化还原调节蛋白产生神经保护作用。促炎症细胞因子可介导神经元凋亡和周围神经病理性疼痛,长期饮用大量酒精所致的神经病理性疼痛是否与促炎症细胞因子的产生有关以及Res对APN的治疗作用尚需要进一步探讨。本课题利用酒精诱发的APN疼痛的动物模型,通过检测大鼠的痛觉行为学改变,观察坐骨神经光镜水平的形态学和电镜水平的超微结构改变,以及检测坐骨神经内MDA、GSH、亚硝酸盐、SOD、肿瘤坏死因子-α(tumor nectosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平的变化,综合分析酒精所致APN的病理发生机制及Res对酒精诱发的APN的治疗作用。结果显示：(1)大鼠经酒精灌胃6w后即可出现触觉异常性疼痛和热痛觉过敏,至第12w,触觉异常性疼痛和热痛觉过敏更加明显。(2)对于酒精诱发的APN疼痛大鼠,应用Res后可缓解酒精所致的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏。(3)给APN大鼠应用Res后,坐骨神经光镜水平的形态学和电镜水平的超微结构均出现明显改善。(4)酒精诱发的APN大鼠,坐骨神经组织的氧化应激反应增强,应用Res可抑制酒精诱发的氧化应激反应。(5)酒精可引起坐骨神经组织内促炎症细胞因子的水平升高,应用Res可抑制这些促炎症细胞因子水平的上升。以上结果表明,给大鼠长期饮用酒精可对周围神经组织产生明显的损伤作用,并导致动物的痛觉行为学发生改变。酒精对周围神经组织的损伤作用是多方面的,不仅直接引起神经超微结构的改变,而且还增强氧化应激反应和促进促炎症细胞因子的表达,这些变化可能会进一步加重神经的形态学变化。应用Res可从多个方面或层次改善酒精所致的周围神经损伤。这些研究结果不仅对酒精所致的周围神经损伤研究提供了新的实验资料,而且对开发APN的新的治疗措施提供了具有指导意义的理论基础和实验依据。不可否认,本课题的研究结果对于将来采用Res和其衍生物预防或治疗APN具有实际指导意义。