[目的]　　 通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)及小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)的离体培养,观察植物雌激素α-ZAL对同型半胱氨酸(Hcy)诱导细胞损伤的作用,与内源性雌激素17β-雌二醇(17β-E2)的作用进行比较,并初步探讨其作用机制。　　 [方法]　　 1、细胞培养及处理:胶原酶消化法原代培养HUVECs,密度梯度离心法原代培养小鼠骨髓EPCs,选用2～4代细胞用于实验。细胞分组如下:(1)空白对照组(Vehicle):(2)Hey组--作时间浓度曲线;(3)α-ZAL预干预+Hcy刺激组;(4)17β-E2预干预+Hcy刺激组。根据细胞存活率的实验结果,分别选用500μmol/LHcy作用于HUVECs24h和2000μmol/LHcy作用于EPCs24h作为Hcy刺激条件,并用α-ZAL或17β-E2(10-8～10-6mol/L)预干预细胞30min,检测相关指标变化情况。　　 2、检测指标:(1)HUVECs鉴定:免疫荧光法检测内皮细胞MarkereNOS及VE-cadherin的表达:小鼠EPCs鉴定:免疫荧光法检测内皮细胞MarkerVE-cadherin、Flk-1(VEGFR-2)和干细胞MarkerCD133的表达,Dil标记低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)摄取及荆豆凝集素(UEA-1)结合情况;(2)细胞存活率:MTT法;(3)细胞坏死情况:比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;(4)细胞凋亡情况:TUNEL荧光染色阳性细胞数,WesternBlot法检测凋亡蛋白酶Caspase-3的表达;(5)细胞凋亡线粒体途径信号蛋白的变化情况:WesternBlot法检测Caspase-9及Bax表达,免疫组化法检测Caspase-9,Bax,Bcl-2及Bcl-XL蛋白的表达。　　 [结果]　　 1、HUVECs部分　　 (1)HUVECs培养鉴定:光镜下细胞呈典型的铺路石样镶嵌排列,细胞边界清晰,细胞核为圆形或椭圆形,核仁明显。免疫荧光染色结果示内皮细胞MarkereNOS及VE-cadherin表达阳性。(2)Hcy导致HUVECs存活率降低,细胞损伤加重:Hcy可浓度(0,10,20,50,100,200,500,1000,2000μmol/L)及时间(12,24,36h)依赖性的降低HUVECs存活率。统计学分析后选择500μmol/L的浓度作用24h作为Hcy刺激HUVECs的条件。500μmol/LHcy作用24h可诱导释放到细胞培养上清液中的LDH活性增加,提示细胞坏死情况加重;TUNEL荧光染色阳性细胞数及凋亡蛋白酶Caspase-3表达增加,提示细胞凋亡情况加重。(3)α-ZAL预干预可提高HUVECs细胞存活率,减轻细胞损伤:用α-ZAL(10-8～10-6mol/L)预干预后,能减轻Hcy引起的细胞凋亡,降低细胞培养上清液中的LDH活性,提高细胞存活率,其作用与17β-E2相似。(4)Hcy可上调HUVECsBax蛋白表达,下调Bcl-2及Bcl-XL蛋白表达,增加Caspase-9表达,而α-ZAL预干预可逆转上述变化。WesternBlot及免疫组化研究发现Hcy可上调HUVECsBax蛋白表达,下调Bcl-2及Bcl-XL蛋白表达,增加Caspase-9表达,提示Hcy可通过激活线粒体途径而诱导HUVECs凋亡,α-ZAL(10-8～10-6mol/L)预干预后,能抑制上述指标的变化,其作用与17β-E2相似,提示α-ZAL的抗凋亡作用可能与抑制线粒体途径有关。　　 2、EPCs部分(1)小鼠骨髓EPCs培养鉴定:光镜下细胞可见典型的铺路石样外观。免疫荧光检染色示内皮细胞MarkerVE-cadherin、Flk-1(VEGFR-2)及干细胞MarkerCD133表达阳性,Dil-ac-LDL摄取和FITC-UEA-1结合实验阳性。(2)Hcy导致EPCs存活率降低,凋亡加重:用梯度浓度的Hcy(0,200,500,1000,2000,5000μmol/L)作用24h,随着Hcy浓度增加EPCs细胞存活率降低,在2000,5000μmol/L时和正常对照组相比有统计学意义。用2000μmol/LHcy作用EPCs24h,TUNEL荧光染色阳性细胞数及凋亡蛋白酶Caspase-3表达增加,提示细胞凋亡情况加重。　　 (3)α-ZAL预干预可提高EPCs细胞存活率,减轻细胞凋亡:用10-7mol/Lα-ZAL预干预后,能减轻Hcy引起的细胞凋亡,提高细胞存活率,其作用与17β-E2相似。　　 [结论]　　 植物雌激素α-ZAL可减轻Hcy引起的HUVECs及小鼠骨髓EPCs的损伤,其对细胞的保护作用与17β-E2相似;机制与降低Hcy引起的HUVECs及EPCs凋亡有关;α-ZAL可能通过抑制线粒体途径来减轻Hcy引起的HUVECs凋亡。