【摘 要】
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骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal stem cells,BMSCs）是一种成体干细胞,可微创重复取材,体外扩增能力强,被证明具有良好的软骨形成能力,是组织工程化软骨构建的理想种子细胞,但是BMSCs再生软骨在异位环境的骨化问题,严重限制了它在皮下软骨缺损（比如鼻子,耳朵）上的应用。与BMSCs不同,软骨细胞可以在异位环境维持稳定的软骨表型,这可能跟抗血管化因子的存在有关。软
【基金项目】
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国家“863”计划项目（2012AA020507）； 国家自然基金（31271046, 81301338, 81371703）；
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骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal stem cells,BMSCs）是一种成体干细胞,可微创重复取材,体外扩增能力强,被证明具有良好的软骨形成能力,是组织工程化软骨构建的理想种子细胞,但是BMSCs再生软骨在异位环境的骨化问题,严重限制了它在皮下软骨缺损（比如鼻子,耳朵）上的应用。与BMSCs不同,软骨细胞可以在异位环境维持稳定的软骨表型,这可能跟抗血管化因子的存在有关。软骨调节素-Ⅰ（Chondromodulin-Ⅰ,Chm-Ⅰ）作为软骨中典型的抗血管化因子之一,在调控软骨生长、抑制血管化和肿瘤形成方面被广泛的报导。因此阐明Chm-Ⅰ对软骨细胞的特性和功能,以及异位软骨再生及再生软骨稳定性的影响可以有助于解决BMSCs异位骨化问题。针对上述问题,本论文第一章重点探讨了Chm-Ⅰ在维持软骨细胞再生软骨异位稳定性中的作用。目前的研究证明Chm-Ⅰ基因敲除(Chm-Ⅰ-/-,KO)没有对原位关节软骨发育产生影响,但是Chm-Ⅰ基因敲除小鼠的关节软骨在移植到裸鼠皮下16天后,表现出明显的骨化,而野生型（Wild type,WT）小鼠的关节软骨在异位移植相同的时间后依然保持着稳定的软骨表型。从细胞形态、软骨特异性基质表达和pellet培养方面表明Chm-Ⅰ基因敲除并没有明显影响体外培养的软骨细胞的表型、功能和成软骨能力,除了WT组比KO组的软骨细胞在增殖速度上略快一些。尽管如此,将软骨细胞混合matrigel注射到裸鼠皮下时,Chm-Ⅰ基因敲除直接影响了软骨细胞异位形成软骨的能力,表现为明显的血管入侵。更进一步的,将体外再生的软骨组织移植到皮下环境后,Chm-Ⅰ基因敲除明显弱化了再生软骨组织维持异位稳定的能力,表现为早期的骨化。这些结果表明Chm-Ⅰ是异位软骨再生和再生软骨稳态的维持不可缺少的重要因素。在上述证实Chm-Ⅰ在维持软骨细胞再生软骨异位稳定作用的基础上,本论文第二部分探讨了Chm-Ⅰ在BMSCs再生软骨异位稳定性中的作用。小鼠无疑是研究这个问题的最佳模型,但是小鼠骨髓细胞成份更为复杂,BMSCs比例低,目前也没有稳定的三维成软骨体系。目前的研究证明通过碎骨片和骨髓液混合培养的原代骨髓细胞,经lineage磁珠阴选后,得到的第一代骨髓细胞具有较高的纯度以及较好的增殖活力和分化能力;应用pellet模型,通过不同软骨诱导方案的比较,确定诱导效果最好的方案,最后建立了稳定的小鼠BMSCs培养和软骨再生体系。在此基础上,通过比较WT和Chm-Ⅰ-/-小鼠BMSCs体外再生软骨pellet在组织结构,软骨特异性基质表达方面的差异,明确Chm-Ⅰ基因敲除对BMSCs体外再生软骨能力没有明显影响。尽管如此,体外长时间软骨诱导成熟的Chm-Ⅰ-/-小鼠BMSCs再生软骨pellet,在移植到裸鼠皮下后,较早的发生了骨化。这些结果表明Chm-Ⅰ对于维持BMSCs再生软骨异位稳定性方面有着重要作用。
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