背景与目的：非吻合性胆管狭窄（non-anastomotic biliary stricture，NABS）是目前肝移植术后胆道并发症的主要类型，其病理基础是胆管上皮损伤后局部异常修复所致的移植肝胆管纤维化。研究发现，冷保存再灌注损伤（cold preservation reperfusion injury，CPRI）是移植肝胆管纤维化发生的独立影响因素，但其发病机制有待进一步阐明。新近研究发现，胆管上皮细胞（biliary epithelial cell，BEC）可通过上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）成为肝胆管纤维化过程中基质生成细胞的主要异质性来源。EMT指上皮细胞在特定条件下逐渐获取失去其表型，同时获取间质细胞特性的转化过程，在胚胎发育、肿瘤转移及创伤修复过程中发挥重要作用。研究证实，肾小管上皮细胞及肺泡上皮细胞EMT分别是肾脏和肺脏纤维化形成的重要机制。而在原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎发病机制中，BEC EMT是导致肝胆道纤维化的关键因素。体外实验业已证实，成熟的BEC可在细胞因子/促炎因子刺激下发生EMT，动物实验中也同样观察到了大鼠移植肝BEC EMT现象。以上研究结果提示：BEC EMT很可能参与了CPRI导致的移植肝胆管纤维化过程。CPRI是肝移植术中不可避免的病理过程，而IL-6则是其作用于BEC的主要效应介质。正常情况下，BEC低表达IL-6，在损伤因素的作用下可诱导IL-6高表达，通过结合其在BEC上的受体gp130激活STAT3磷酸化。研究发现，IL-6/STAT3信号通路的活化与胆管上皮细胞的增殖、修复及屏障功能密切相关，而IL-6-/-的小鼠则因丧失上皮修复及屏障功能而导致胆管树完整性破坏。既往研究发现，经CPRI或rhIL-6处理受体大鼠后，可致移植肝BEC内STAT3磷酸化，进而诱导细胞增殖；同时，随着冷保存时间的延长或rhIL-6剂量的增加，还观察到管周肌纤维母细胞聚集和胶原沉积现象，BEC同时表达胆管上皮和间质两种标志物。研究结果提示：CPRI可能通过活化IL-6/STAT3，诱导BEC发生EMT，进而成为移植肝胆管纤维化中基质生成细胞的主要来源。三叶因子3（trefoil factor family3，TFF3）是近年来研究较多的一种小分子多肽，属三叶因子家族，其在胃肠道上皮的损伤修复过程中起重要作用。新近研究表明，TFF3在IL-6/STAT3信号通路的调控下，通过增强BEC移行能力，参与了胆管上皮的损伤修复。鉴于TFF3主要高表达于肝门区及肝内大胆管，与肝移植术后NABS的病变部位一致，因此，TFF3很可能在CPRI诱导的BEC EMT及移植肝胆管纤维化过程中发挥关键调控作用。基于以上理论基础及研究结果，我们推测：CPRI通过激活IL-6/STAT3信号通路，从而诱导BEC EMT，且TFF3作为该信号通路下游因子，对BEC EMT发挥关键调控作用。本研究旨在阐明IL-6/STAT3/TFF3信号通路在CPRI诱导BEC EMT过程中的作用及机制，研究结果有望进一步阐明移植肝胆管纤维化的发病机制，同时为临床肝移植术后NABS的防治提供新的靶点。方法：1.收集我院自2002年11月至2011年1月因NABS行再次肝移植患者的病肝标本，经初步筛选后行免疫组织化学染色，观察上皮标志物（CK19、E-cadherin）及间质标志物（a-SMA、Vimentin）在病肝BEC中的表达情况，同时明确TFF3在上述部位是否表达。2.体外培养hBEC并建立CPRI的细胞模型，通过QRT-PCR和WB检测IL-6/STAT3/TFF3信号通路各因子及上皮标志物（CK19、E-cadherin）和间质标志物（a-SMA、Vimentin）在BEC中的mRNA/蛋白表达情况；利用rhIL-6、IL-6中和性抗体、STAT3磷酸化特异性抑制剂STATTIC、转染TFF3siRNA、rhTFF3分别上调、下调该信号通路各因子，观察相应下游因子及EMT相关标志物的表达变化；制备的TFF3腺病毒载体并转染hBEC，通过细胞划痕实验观察TFF3对hBEC迁移能力的直接影响。3.通过建立重建肝动脉的SD大鼠原位肝移植模型在真实病理状态下进一步验证CPRI对BEC的作用。分别设定不同的供肝冷保存时间（1h、6h、12h），于术后不同时相点（1d，3d，7d，14d）采集标本，对包含对照组共计16个组别（n=5）的大鼠移植肝胆管组织进行QRT-PCR及WB检测，明确IL-6/STAT3/TFF3信号通路各因子及上皮标志物（CK19、E-cadherin）和间质标志物（a-SMA、Vimentin）在BEC中的mRNA/蛋白表达变化情况。结果：1.免疫组织化学染色显示：患者病肝BEC在表达上皮标志物（CK19、E-cadherin）的同时，还表达了间质标志物（a-SMA、Vimentin），而TFF3也在上述部位高表达。结果提示移植肝胆管BEC的确发生了EMT，TFF3可能参与这一过程的调控。2. QRT-PCR及WB结果显示，体外模拟CPRI或加入rhIL-6均可引起IL-6/STAT3/TFF3在hBEC中的表达显著上调，同时其CK19、E-cadherin表达下调，伴随a-SMA、Vimentin表达上调；分别应用中和性IL-6抗体、STATTIC、TFF3siRNA阻断该信号通路后可明显抑制CPRI的作用；而加入rhTFF3对BEC EMT具有直接诱导作用；此外，感染TFF3腺病毒的hBEC移行能力明显增强。结果提示CPRI通过活化IL-6/STAT3信号通路，上调TFF3表达，进而诱导BEC EMT，且TFF3对BEC EMT具有关键调控作用。3. QRT-PCR结果显示，大鼠移植肝BEC表达IL-6及TFF3mRNA明显上调，同时CK19、E-cadherin表达下调，伴随a-SMA、Vimentin表达上调，表达差异随供肝冷保存时间的延长而愈加显著；WB结果显示移植肝BEC中各蛋白表达变化与mRNA一致，在此过程中p-STAT3表达亦逐渐上调。结果提示大鼠移植肝BEC中IL-6/STAT3/TFF3信号通路被明显激活，并伴随BEC EMT，CPRI是导致上述效应的主要因素。结论：CPRI可激活IL-6/STAT3信号通路，通过上调TFF3的表达，对BEC EMT发挥关键调控作用，这一损伤后修复过程可能是移植肝胆管纤维化的重要机制之一。