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前言随着近年来对肠粘膜屏障功能了解的不断深入,其在多种疾病中的作用愈来愈引起人们的重视。越来越多的证据表明,肠粘膜屏障功能的异常及其继发的细菌移位,参与了多种疾病发生发展的病理生理过程。我们在近期对胆色素结石的研究工作中注意到,饮食诱导的叙利亚金黄地鼠和豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中,肠道屏障功能可能存在异常,研究发现诱导成石模型的肠道通透性相对良好,肠粘膜机械屏障部分破坏。因此我们可以提出假设,肠粘膜的生物屏障和免疫屏障是否也同时存在改变,肠道粘膜免疫和生物屏障功能异常是否在胆色素结石形成的某些环节中也发挥一定作用呢?我们选用较常用的致石食谱诱导的豚鼠胆囊胆色素结石动物模型来进行观察。沿着肠屏障功能异常—细菌移位—胆汁酶学改变—胆色素结石形成的线索,对反映肠粘膜屏障功能的肠粘膜形态学和肠粘膜免疫屏障功能等系列指标进行了检测,以期了解胆色素结石形成过程与肠粘膜屏障功能异常相关性的证据。并进一步应用肠粘膜保护剂谷氨酰胺进行干预,观察其对结石形成率以及肠道粘膜免疫屏障的影响,旨在从一个新的角度—肠粘膜屏障功能,来探讨胆色素结石的形成机制。实验方法一、实验对象豚鼠80只,雌雄各半,体质量200～250g,按照随机原则分为三组:对照组(CON组)20只;致石组(PS组)30只;谷氨酰胺组(GLN组)30只;对照组给予普通豚鼠饲料,致石组给予致石饲料喂养,谷氨酰胺组给予添加谷氨酰胺的致石饲料,各饲养8周,观察各指标。二、标本采集采集鼠末端回肠组织标本。三、检测指标(一)致石率评定及红外光谱结石定性:解剖显露豚鼠胆囊,肉眼即可清晰辨别胆囊结石形成情况,采用红外光谱溴化钾压片法,对结石成分进行定性,统计结石形成率。(二)肠粘膜细胞光镜观察:取距离回盲部5cm的回肠组织,石蜡包埋,HE染色光镜下观察,绒毛的高度,绒毛宽度,分别计数4个高倍镜下(400×)肠粘膜固有层和上皮内的淋巴细胞数,取其均值。(三)免疫组化法标记计数肠粘膜淋巴细胞:取距离回盲部5cm的回肠组织,免疫组化法处理,镜检棕黄色着色者为阳性细胞。分别记数4个高倍镜下(400×)CD3~+ T细胞数和CD40~+ B细胞数,取其均值。(四)免疫组化法标记肠粘膜分泌IgA的浆细胞:取距离回盲部5cm的回肠组织,免疫组化法处理后,镜检棕黄色着色者为阳性细胞。分别记数4个高倍镜下(400×)阳性浆细胞数。实验结果1、豚鼠胆囊胆色素结石模型构建情况:饲养8周,CON组豚鼠成石率为20%,致石组成石率为68.4%,使用谷氨酰胺作为肠粘膜保护剂的GLN组,成石率为36.8%(p＜0.05),低于成石组。结石定性鉴定为胆色素结石。2、肠粘膜细胞光镜观察:与CON组相比,PS组肠粘膜细胞绒毛排列紊乱,肠粘膜出现水肿和少量炎性细胞浸润,血管扩张,肠壁各层变薄,绒毛高度降低,宽度减小;GLN组微绒毛排列略稀疏,水肿炎症情况较轻。分别计数固有层和上皮内的淋巴细胞总数,结果表明PS组和GLN组的淋巴细胞数均要低于CON组(P＜0.01,P＜0.05);而GLN组的阳性淋巴细胞高于PS组(P＜0.01,P＜0.05),见表1。表1,鼠回肠末端固有层淋巴细胞数和上皮层淋巴细胞数(×400)x±s3、免疫组化法标记计数肠粘膜淋巴细胞:对各组肠粘膜的CD3~+ T细胞数和CD40~+ B细胞数进行记数,结果表明PS组和GLN组的阳性T和B淋巴细胞均要低于CON组(P＜0.01,P＜0.05);而GLN组的阳性淋巴细胞高于PS组(P＜0.01,P＜0.05),见表2。表2,鼠回肠末端粘膜层CD3~+ CD40~+阳性淋巴细胞,IgA~+浆细胞(×400)4、免疫组化法标记肠粘膜分泌IgA的浆细胞:对各组IgA染色阳性的细胞数进行记数,结果表明PS组和GLN组的阳性浆细胞数均要低于CON组(P＜0.01,P＜0.05);而GLN组的阳性浆细胞数高于PS组(P＜0.01),见表2。结论1、饮食诱导的豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中,存在肠粘膜机械屏障和免疫屏障功能异常;胆色素结石的形成与肠粘膜机械屏障和免疫屏障功能异常具有一定相关性。2、谷氨酰胺可改善成石模型中豚鼠的肠粘膜屏障功能,同时可降低胆色素结石的形成率;3、肠屏障功能改变可能参与影响胆色素结石形成。细菌移位以及胆汁β—葡萄糖苷酸酶活性改变可能是肠粘膜屏障功能参与影响胆色素结石形成的机制之一。本实验注意到了胆色素结石形成中肠粘膜免疫屏障功能异常,机械屏障功能异常,并对其机制进行了初步推测,其具体关系有待进一步研究证实。