论文部分内容阅读
遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)是一个以常染色体显性遗传为主的癫痫综合征,其基因型和表型具有很大的异质性。目前已知的致病基因主要是钠离子通道基因,仍有很多致病基因不明,很多未知致病基因或易感基因需进一步发掘和探索。本研究主要对于GEFS+家系钾通道致病基因研究,应用二代测序加目标基因靶向捕获对钾通道基因捕获、然后进行相关功能验证,寻找GEFS+的致病基因,继而探讨GEFS+与海马氢质子波谱(～H Magnetic resonance spectroscopy,MRS)改变的关系。研究对象及方法收集2012年1月～2016年12月就诊于广东省人民医院小儿癫痫专科门诊及病房GEFS+患儿,据2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)的癫痫及癫痫综合征的诊断标准和GEFS+定义。收集14个GEFS+家系,先证者14人及家系成员共48人,行二代测序加癫痫目标基因靶向捕获技术检测。在一个GEFS+家系发现KCNQ4基因的错义突变(P537S),应用以上技术再在另13个GEFS+家系和26个热性惊厥(Febrile seizures,FS)先证者及家系验证,通过Sanger测序对发现的KCNQ4突变位点在200例健康人群验证。选取KCNQ4P537S构建质粒脂质体转染HEK293细胞,通过荧光定量PCR比较KCNQ4P537S与KCNQ4野生型组(WT)mRNA水平,Westernblot比较KCNQ4P537S与KCNQ4WT蛋白水平,构建Kv7.4P537S纯合及Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT杂合通道,再通过全细胞膜片钳检测Kv7.4 P537S电流与野生型的差异。在此基础上,14例GEFS+先证者行海马MRS检查,计算双侧海马NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/(Cho+Cr)值与对照组比较。结果1.在14个GEFS+家系中,发现一个KCNQ4基因突变c.1609C>T,位于外显子12上,可导致蛋白质发生如下变异:p.Pro537Ser(脯氨酸→丝氨酸)。另26个FS家系验证中又发现KCNQ4两个突变:c.1177G>T、c.1207G>A位于外显子9上,可分别导致以下蛋白质变异:p.Gly393Cys(甘氨酸→半胱氨酸),p.Ala403Thr(丙氨酸→苏氨酸)。每个病人仅携带其中一个突变。以上位点国内外未见报道。2.GEFS+家系外及健康人群验证未发现以上突变。3.荧光定量PCR:KCNQ4 P537S mRNA相对于KCNQ4WT表达量为0.776852,二组mRNA表达量差异比较p值0.1,差异无统计学意义。4.Western blot:KCNQ4P537S蛋白表达量相对于KCNQ4WT蛋白表达量,二组比较差异p值0.0289,差异有统计学意义。5.膜片钳:细胞膜电压钳制于-90mV,阶跃刺激从-70mV开始至+60mV,步阶 10mV,Kv7.4 P537S 和 Kv7.4 WT 组、Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT 组和 Kv7.4 WT/Kv7.3 WT组钾离子通道约在电压-70mv开放,当电压达到50mV左右时通道电流达到峰值,Kv7.4P537S组电流密度为13.27±2.144 pA/pF(n=10),Kv7.4 WT电流密度为25.8±4.147pA/pF(n=8),二者比较P值0.0116,差异有统计学意义。Kv7.4 P537S 组的 I-V 曲线较 Kv7.4 WT 组右移。Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT组电流密度为 32.15 ±2.622 pA/pF(n=8),Kv7.4 WT/Kv7.3 WT 电流密度为 61.69±9.225 pA/pF(n=10),二者比较值 0.0135,差异有统计学意义。Kv7.4 P537S/Kv 7.3 WT组I-V曲线较Kv7.4 WT/Kv7.3 WT组右移。Kv7.4 WT的激活曲线V50为14.3mv,而Kv7.4 P537S为11.3mv,二者比较差异无统计学意义。Kv7.4 WT/Kv7.3WT 组 V50 为 3.485mv,而 Kv7.4P537S/Kv7.3WT 为 9.955mv,二者比较差异有统计学意义,而且Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT激活曲线右移。6.本研究GEFS+患儿双侧海马波谱NAA/(Cr+Cho)平均值0.71±0.11,正常对照组0.74±0.10,p值0.214,差异无统计学意义。结论1.发现一个GEFS+家系KCNQ4基因突变c.1609C>T,另26个FS家系验证中发现 KCNQ4 两个突变:c.1177G>T、c.1207G>A。2.KCNQ4P537S影响了蛋白质结构的稳定性。3.膜片钳结果显示KCNQ4P537S对细胞膜电位产生影响,电流密度下降,细胞膜上离子通道开放的数目减少,细胞膜复极过程延长,对神经元兴奋活动抑制下降,从而引起神经元兴奋性增高,引起癫痫的发生。4.KCNQ4可能是中国人群GEFS+的新的突变基因。5.本研究GEFS+患儿海马功能磁共振(MRS)未见改变。