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目的:利用慢病毒表达载体,构建第三代靶向EGFRvⅢ的CAR基因表达框(EGFRvⅢ-CAR),进行慢病毒包装,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat T细胞,通过筛选获得稳定表达CAR的Jurkat单克隆细胞株,验证第三代CAR修饰的Jurkat T细胞的体外靶向作用。方法:重叠PCR法获取EGFRvⅢ-CAR基因,构建慢病毒重组质粒。通过非脂质体转染试剂将包装质粒psPAX2、包膜蛋白质粒pMD2.G和含目的基因的重组慢病毒质粒共转染293T细胞,进行慢病毒包装,收集病毒上清;用超滤管浓缩慢病毒,将浓缩的病毒用荧光计数法进行慢病毒滴度的检测。慢病毒感染293T,western-blot法检测CAR在293T的表达;重组慢病毒感染Jurkat细胞,用嘌呤霉素进行筛选获得稳定表达CAR的Jurkat单克隆细胞株,提取Jurkat-CAR T细胞单克隆细胞基因组DNA,用PCR验证CAR基因整合到Jurkat T细胞;Jurkat-CAR T细胞与EGFRvⅢ分子接触后CCK-8法检测其增殖;ELISA法测Jurkat-CAR T细胞与U87MG细胞共培养的IL-2分泌量。结果:1、成功构建 pCDH-EGFRvⅢscFv-CAR-copGFP-T2A-puro 慢病毒表达重组质粒,转染293T细胞,经western-blot验证CAR基因能正常表达。2、通过三质粒psPAX2、pMD2G和含目的基因的重组质粒共转染293T细胞,成功包装出慢病毒,将病毒浓缩,并测得病毒的滴度为4×106TU/mL。慢病毒感染293T,经Western-Blot验证CAR蛋白能正常表达。3、慢病毒感染Jurkat T细胞,筛选获得稳定表达CAR的Jurkat T细胞株;提取筛选细胞株基因组DNA,经PCR验证发现CAR基因有整合到Jurkat T细胞中。4、Jurkat-CAR单克隆细胞EGFRvⅢ分子接触后CCK-8法检测其增殖,发现Jurkat-CAR细胞有明显的增殖作用;Jurkat-CAR单克隆细胞与U87MG细胞共培养,通过ELISA法检测到IL-2的分泌量比阴性对照有显著升高。结论:成功筛选到稳定表达第三代EGFRvⅢ-CAR的细胞单克隆,并且此细胞单克隆对EGFRvⅢ有明显靶向作用,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础。