肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤,是与癌症相关的第三大死亡原因,每年约导致696,000人死亡。虽然晚期肝癌的预后在过去20年中有了较大提高,但5年生存率仍很低,最有效的治疗方法是外科切除,但是在肿瘤晚期就丧失了手术机会。超声、CT和MRI这些传统的检查方法有助于监测肿瘤的发生部位和是否转移,但对早期肝癌的检查是有限的,单独应用这些检查有可能会误诊。迄今为止,甲胎蛋白(AFP)是发现肝癌最重要的血清学肿瘤标志物,然而,将近40%的肝癌是小肝癌和AFP水平正常的肝癌。因此,发现一种能早期诊断肝癌并指导临床治疗和评价预后的因子就非常重要。分子伴侣蛋白TCP1复合物(CCT),也称作TRi C和c-cpn,在细胞中介导蛋白折叠,伴侣蛋白是ATP依赖性折叠蛋白,表达在所有生物体中。他们由两个背靠背的低聚环堆积而成,使蛋白底物结合并折叠。CCT3(60k Da)是CCT/TRi C复合物主要的亚基,在蛋白折叠和再折叠过程中特异性地发挥作用。一些研究已经通过RT-PCR和western blot法监测到肝癌患者中CCT3过表达,CCT3通过使转录因子磷酸化,并且激活进入肝癌细胞核的转录因子(STAT)3/STAT3而影响肝癌的进程。CCT3可能在调节微管结构和功能(捕捉着丝粒)中发挥作用,影响细胞对这些微管靶点的敏感性。含有GTP酶异亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQGAP)家族包含三个成员:IQGAP1,IQGAP2 and IQGAP3,IQGAP3是家族中新近发现的。目前研究中发现,它参与上皮细胞的增生,然而,在肿瘤发生中的作用仍不明确。IQGAP3可能通过RAS/ERK1/2途径调节细胞增殖。已经发现增生的肝细胞中细胞间的连接处IQGAP3表达上调。IQGAP3相关的信号途径可能作为复杂信号通道中的一部分参与肝细胞再生。Ras-,Rac-,和Cdc42结合IQGAP3后对肝细胞再生的作用,表明IQGAP3可能在细胞增殖和组织重建中有效地介导这些信号进程。本研究拟应用基因转染和RNA干扰技术进一步探讨CCT3和IQGAP3在肝癌的发生发展及侵袭过程中的作用。采用不同转移潜能的肝癌细胞株和非瘤肝细胞株,应用载体转染方法设计并合成CCT3、IQGAP3基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),将si RNA转染人肝癌细胞株干扰CCT3、IQGAP3基因的表达,观察CCT3、IQGAP3基因表达沉默后对肝癌细胞株侵袭能力的影响,同时采用Western-blot法检测细胞转染前后一些信号通路的表达,目的是探讨CCT3、IQGAP3对肝癌的诊断价值,为提高肝癌治疗手段及改善预后提供理论依据。本研究的创新点:1.本研究中我们首次在肝癌、肝硬化和健康人群中的血清中检测CCT3和IQGAP3的表达,并评估其用来诊断小肝癌和AFP阴性肝癌的价值,我们的研究证明了CCT3和IQGAP3对肝癌的诊断有显著作用,并且其表达独立于AFP,尤其当AFP阴性或是早期肝癌时,诊断价值非常高,因此,CCT3、IQGAP3联合AFP能提高肝癌诊断的敏感性和特异性,2.初步探索了CCT3促进肝癌发生、发展、侵袭的作用机制,提示CCT3的促肿瘤生长作用和JAK/STATs信号通路存在密切的联系,CCT3促进肝癌侵袭作用的部分机制可能与JAK/STATs活化通路有关。3.进一步了解IQGAP3促进肝癌细胞增殖和侵袭的作用机制,提示IQGAP3的促进肿瘤细胞增殖和侵袭的作用和Ras/ERK信号通路之间关系密切,Ras家族蛋白Rac/Cdc42在肝癌的发生、发展中起重要作用,为开展肝癌基因靶向治疗奠定了理论基础。第一部分CCT3、IQGAP3在肝癌血清中的表达及其与肝癌临床指标之间的关系目的:评价伴侣蛋白复合物TCP1亚基3(CCT3)和含有GTP酶异亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQGAP3)在肝癌患者血清中的诊断价值。方法:收集126例肝癌患者,88例肝硬化和50例健康人群的血清,通过ELISA方法检测甲胎蛋白、CCT3和IQGAP3的水平。结果:在肝癌患者的血清中,CCT3和IQGAP3的表达与肝硬化和健康对照组相比较明显升高,CCT3和IQGAP3蛋白水平均与肝癌患者的病因、肿瘤大小,TNM分期和Child Pugh分级有关,在肝癌诊断上CCT3的敏感度优于AFP(0.846 vs0.667),CCT3和IQGAP3蛋白可以用来诊断甲胎蛋白阴性的肝癌,其灵敏性和特异性分别为92.1%,70.5%和81.6%,71.6%。在小肝癌组,CCT3和IQGAP3蛋白的敏感性分别是76.1%和75.3%,把AFP、CCT3和IQGAP3结合起来曲线下面积为0.954,其诊断能力较单独应用AFP的曲线下面积0.815明显增加(P<0.01)。结论:CCT3和IQGAP3可以作为肝癌的诊断因子,尤其是在AFP阴性肝癌和小肝癌时。第二部分CCT3在肝癌细胞系侵袭中的作用及机制研究目的:研究CCT3基因在肝癌细胞的生物学作用,检测非瘤肝细胞系及两种肝癌细胞系中CCT3基因的表达情况,设计并合成CCT3基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),研究CCT3在肝癌细胞系侵袭中的作用及其相关机制。方法:用Western blot方法检测三种不同侵袭能力的细胞系中CCT3蛋白的表达情况,设计并合成CCT3基因的si RNA,采用脂质体转染Hep G2细胞及MHCC97H细胞,通过Rt PCR法和Western blot法检测转染后三组细胞CCT3m RNA和蛋白的表达。通过transwell小室基质侵袭实验,应用特异性CCT3-si RNA转染的Hep G2及MHCC97-H细胞,观察沉默CCT3表达之后,Hep G2及MHCC97-H肝癌细胞系侵袭能力的变化,同时采用Western blot方法检测转染前后两种细胞系中STAT3和(p)STAT3的表达。结果:相比非瘤肝细胞,CCT3在MHCC97H及Hep G2两种肝癌细胞系中均高表达。特异性CCT3-si RNA转染肝癌细胞后,通过Rt PCR和western blot的方法发现CCT3蛋白以及m RNA的表达均明显降低,表明si RNA能成功的抑制CCT3的表达。应用特异性CCT3-si RNA抑制肝癌细胞系中CCT3的表达,transwell小室基质侵袭实验结果显示:CCT3-si RNA组两组肝癌细胞系穿膜的细胞数目显著减少。Western blot实验检测发现,CCT3-si RNA组两种细胞的STAT3和(p)STAT3的表达均降低。结论:CCT3在肝癌侵袭过程中起了调控作用,CCT3-si RNA抑制了两种肝癌细胞系的侵袭能力,下调了STAT3和(p)STAT3的表达,CCT3可能通过调控JAK/STATs信号通路来影响肝癌的侵袭转移。第三部分IQGAP3在肝癌细胞系侵袭中的作用及机制研究目的:明确IQGAP3在促进肝癌细胞侵袭和增殖过程中的作用及机制,为探明肝癌的发病分子机制并探求新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。方法:经Western-Blot、q RT-PCR方法分析,下调肝癌细胞株中IQGAP3表达后Ras、ERK1/2的变化,通过Transwell法研究细胞迁移、侵袭能力变化;MTT法检测细胞增殖能力变化。结果:IQGAP3在MHCC97H肝癌细胞系中较非瘤肝细胞细胞表达水平较高,差异有显著性(P<0.01)。通过western blot和实时定量PCR的方法检测发现,经特异性地将IQGAP3-si RNA转染两种肝癌细胞后,IQGAP3蛋白以及m RNA的表达均显著下降,表明si RNA能成功的抑制IQGAP3的表达。通过Transwell和MTT法检测结果表明,转染IQGAP3-si RNA的肝癌细胞,侵袭能力和增殖能力同时下降。我们进一步分析探讨存在的可能机制,应用western blot法,研究Ras和ERK1/2蛋白的表达,发现转染后,表达较对照组明显下降。结论:初步探讨了IQGAP3的表达对肝癌细胞在体外的生物学行为的影响,发现IQGAP3能促进肝癌细胞增殖、侵袭,其分子机制可能是通过激活Ras/ERK1/2信号通路。