研究背景：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一类来源于鼻咽粘膜的恶性肿瘤,具有明显的种族和地理分布[1,2]。中国南部和东南亚地区鼻咽癌每年发病率约为20/100,000,然而,在世界其他地方发病率仅为1/100,000。每年约有80,000新发病例被诊断为鼻咽癌,且其中50,000死于此疾病[3]。根据世界卫生组织的粗略统计,80%左右的鼻咽癌发生在我国,且近年来发病率有逐年升高的趋势。其病因及发病机理尚不完全清楚,普遍认为鼻咽癌的发生是遗传易感性、EB病毒(Epstein-Barr Virus EBV)的感染以及环境因素之间相互作用的结果。目前,放射治疗联合化疗是早期及局部晚期鼻咽癌治疗的标准模式,但放化联合治疗后局部复发率仍高达50%左右,5年总生存率仅为34%-53%[5],转移性鼻咽癌的预后更差[4]。目前研究已经表明鼻咽癌治疗失败的重要原因之一是对放化疗耐受。已经清楚大部分化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用的,因此细胞凋亡的阻滞与肿瘤对化疗的耐药性有密切关系。在鼻咽癌中高表达多种癌基因,如抗凋亡的Bcl-2家族成员、LMP1和c-Myc等[6],Bcl-2被认为是一种广义的抗凋亡基因,编码相对分子量为25×1000u的癌蛋白,Bcl-2蛋白是细胞凋亡相关蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白,与肿瘤的耐药和复发有关,其通过抑制肿瘤细胞凋亡或自体吞噬,进而引起肿瘤的发生、发展。Lu等用FISH和免疫组化方法检测到在80%鼻咽癌标本中Bcl-2呈高表达[7]。另有多数研究表明其高表达能阻碍肿瘤细胞的凋亡,并可能和鼻咽癌的发生、演进及转移密切相关。1990年Reed等首次报道应用反义bcl-2基因治疗抑制白血病细胞生长,以后国内外在体外和动物实验的不断深入,认为反义bcl-2基因治疗还能增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。Bcl-2可成为鼻咽癌治疗的靶向目标。传统治疗的长期疗效欠佳,反义bcl-2基因治疗虽可能开辟鼻咽癌治疗的新前景,但基因治疗目前还面临许多困难。随着人们对Bcl-2家族蛋白与肿瘤关系研究的深入,针对各作用机制的抗肿瘤药物也被相继开发,基于Bcl-2的肿瘤生物治疗手段和优势肽段、有机小分子等新药已经用于某些合适的抗凋亡蛋白。有机小分子及其衍生物是Bcl-2抑制剂开发的重要方向。棉酚(gossypol),系存在于锦葵科棉属植物棉花的种子、茎、叶及根部等器官中的一种含量较高的黄色多元酚类化合物,是一种Bcl-2的小分子阻断剂。研究发现,棉酚的活性成分左旋棉酚主要作用于Bcl-2/Bcl-XL基因,阻止其与促凋亡基因如Bak, Bax, Bad等结合形成异源二聚体,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。而且在体内和体外实验中均表现出有效的抗肿瘤活性,但左旋棉酚分子结构两端的醛基,被认为与毒性相关,虽然作用较弱,但很大程度上限制了人体对左旋棉酚的最大耐受量,另外这种混合物进入人体内容易与其他蛋白结合,减弱药物的治疗效果,增加毒性作用。去除两个醛基后合成的Apogossyplone (ApoG2)是棉酚的一种新型衍生物,对其进行细胞毒性测试,结果表明对肿瘤细胞生长的抑制作用较左旋棉酚强更,具有抗肿瘤活性高、毒性小、稳定性好的特点,显示出更好的发展前景。紫杉醇是提取自太平洋紫杉树树皮的典型的紫杉烷类化疗药物,能抑制细胞有丝分裂中纺锤体的形成,使细胞阻滞于G2/M期,导致细胞凋亡。紫杉醇类与顺铂和5-氟尿嘧啶联合应用对头颈部肿瘤有更好的的治疗效果,这一策略也用于鼻咽癌[8]。近年来,化疗在鼻咽癌治疗中的地位越来越重要,特别是对局部晚期鼻咽癌,同期放化疗较单纯放疗可显著近期疗效和长期生存,同期化疗起着增加放射敏感性以及控制远处微小转移灶的作用。但化疗仍存在着毒副反应较大,容易出现耐药等缺点。自噬和凋亡是两种截然不同的程序性细胞死亡方式,是维持细胞自我平衡的重要机制,在生物组织器官分化、生长、发育、自我更新、疾病发生、肿瘤形成中均有重要作用。既往认为,化疗药物杀灭肿瘤细胞主要是通过诱导细胞凋亡实现的,而自噬一直被认为是细胞生存的一种机制。近年细胞自噬逐渐成为研究热点,研究表明,自噬性细胞死亡是某些化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的另一重要方式。在自噬研究过程中发现Beclinl和LC3是两种重要的自噬基因。Beclinl是最早发现的与自噬相关的基因,Beclinl基因目前作为一种抑癌基因已经基本达成共识。其在40%～75%的人类自发性乳腺癌、卵巢癌及鼻咽癌存在染色体17q21位点等位基因缺失。因此,为了提高鼻咽癌病患的生存率和增强病患对放化疗的耐受力,抗凋亡蛋白Bcl-2已成为研发靶向药物的一个热点。本实验研究探讨ApoG2联合紫杉醇(PTX)作用对人鼻咽癌CNE-2细胞体内外的抑制效果,并初步探讨其可能机制,为鼻咽癌治疗方面提供一些新的研究方向。研究目的：本实验以高表达Bcl-2的CNE-2鼻咽癌细胞为研究对象,旨在探讨ApoG2联合紫杉醇在体内外对鼻咽癌CNE-2细胞是否有协同作用,并进一步探讨ApoG2的作用及可能机制,为ApoG2用于鼻咽癌试验性治疗提供理论依据。实验方法：1.采用MTT体外增殖法研究不同浓度紫杉醇、ApoG2单药及两药联合作用于鼻咽癌细胞系CNE-2的体外增殖抑制作用；2.利用Hoechst33258荧光染色法观察细胞在ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌细胞系CNE-2后引起的细胞核形态的变化；3.利用吖啶橙(AO)荧光染色法观察细胞在ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌细胞系CNE-2后引起的细胞形态的变化；4.流式细胞仪分析ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌细胞系CNE-2后引起的细胞凋亡率及自噬率的变化情况；5.Western blot法检测经ApoG2处理后的CNE-2细胞Bcl-2蛋白的表达变化；6.建立裸鼠移植瘤模型,观察ApoG2、紫杉醇单药及两者联合对鼻咽癌细胞移植瘤的生长抑制作用；7.免疫组化检测各处理组移植瘤组织中Bcl-2及Beclin1蛋白的表达变化。实验结果：1.通过MTT体外增殖实验检测提示ApoG2与紫杉醇单药对鼻咽癌细胞系CNE-2具有生长增殖抑制作用,细胞的抑制作用随药物浓度提高而增强,呈浓度依赖性,并且联合用药组有协同作用(CDI<1)；2.Hoechst33258荧光染色结果提示,ApoG2与紫杉醇联合作用CNE-2细胞48h与对照组及单独处理组相比细胞呈现出更明显核固缩、碎裂,染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡现象;而对照组细胞则呈现弥散均匀,淡蓝色的正常细胞核；3.AO荧光染色结果提示,ApoG2与紫杉醇联合作用CNE-2细胞48h后,胞浆或胞核染成亮红色荧光,为酸性自噬泡,与对照组及单独处理组相比细胞呈现出更明显自噬现象；4.流式细胞检测结果提示,ApoG2联合紫杉醇作用较各单药组能更明显诱导CNE-2细胞发生凋亡,差异有统计学意义(P<0.01)。APoG2与紫杉醇联合作用组自噬荧光强度明显增强,与ApoG2处理组,紫杉醇处理组相比,差异有统计学意义(P<0.01)；5. Western blot法检测Bcl-2蛋白表达结果提示,与空白对照组相比,ApoG2组Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)。6.体内实验显示ApoG2组、紫杉醇组、ApoG2+紫杉醇组对CNE-2裸鼠移植瘤生长的抑制率分别是54.22%、72.34%和85.90%,ApoG2联合紫杉醇较单一治疗组可更明显抑制肿瘤细胞生长(P<0.05)；7.免疫组化法检测Bcl-2和Beclin1蛋白在移植瘤中的表达,与空白对照组相比,ApoG2组及紫杉醇组均出现不同程度的Bcl-2减少和Beclinl增加,但ApoG2+紫杉醇组中的此两种蛋白表达变化较单独紫杉醇和ApoG2组均更明显(P均<0.01)。结论：ApoG2联合紫杉醇在体内外均能增强对鼻咽癌CNE-2细胞的增殖抑制作用,不仅可以提高细胞的凋亡,而且可以提高细胞的自噬性死亡。其机制可能为下调Bcl-2蛋白以及诱导了Beclinl蛋白的表达相关。