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第一部分Runx3基因在毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞中异常表达的临床意义研究目的评估Runt相关转录因子3(Runt-related transcription factor 3 gene,Runx3)基因表达在毛细支气管炎发展为支气管哮喘(以下简称哮喘)中的预测价值,为哮喘的二级预防提供依据。实验方法按分层随机原则收集具有特应性体质的毛细支气管炎患儿(Bronchiolitis group with atopic,Ba组)28例,非特应性体质的毛细支气管炎患儿(Bronchiolitis group with non-atopic,Bn组)26例。对照组也按分层随机原则纳入在本院同期体检的同年龄段健康儿童,分别为特应性对照组(Control group with atopic,Ca组)24例及非特应性对照组(Control group with non-atopic,Cn组)24例。取供者外周血5 ml,3 ml常规抗凝,使用人外周淋巴细胞分离液提取单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后再用Trizol试剂提取完整的RNA样本,备检Runx3基因,另2 ml外周血离心后取血清备检白介素4【Interleukin 4,IL-4(Th2细胞代表因子)】、干扰素γ【Interferon-γ,IFN-γ(Th1细胞代表因子)】。利用实时定量聚合酶链反应(real time PCR,RT-PCR)方法检测Runx3基因的表达水平【参照基因为Ornithine decarboxylase antizyme 1(OAZ1)】;利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测血清IL-4、IFN-γ浓度。实验结果1.外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平Ba组外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平显著低于Bn组、Ca组和Cn组,P<0.05。另外,B组(Bronchiolitis group,Ba+Bn)外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平显著低于C组(Control group,Ca+Cn),P<0.05。2.血清IL-4的含量水平Ba组血清IL-4的含量水平显著高于Cn组,P<0.05;Bn组血清IL-4的含量水平显著高于Cn组,P<0.05;另外,B组血清IL-4的含量水平显著高于C组,P<0.05;在Ca组中,血清IL-4的含量水平显著高于Cn组,P<0.05。3.血清IFN-γ的含量水平Ba组血清IFN-γ的含量水平显著低于Bn组、Ca组和Cn组,P均<0.05;Bn组血清IFN-γ的含量水平显著低于Cn组,P<0.05;另外,B组血清IFN-γ的含量水平显著低于C组,P<0.05;Ca组血清IFN-γ的含量水平显著低于Cn组,P<0.05。4.外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平与血清IL-4含量的相关性外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平与血清IL-4含量呈负相关。其中在Ba、Bn、Ca组中两者呈显著性负相关,P<0.05;在Cn组中两者呈负相关,但相关性不显著。5.外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平与血清IFN-γ含量的相关性四组外周血单个核细胞中Runx3基因的表达水平均与血清IFN-γ含量呈显著正相关,P<0.05。实验结论1.特应性体质毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞Runx3基因的表达下降,血清IL-4升高,IFN-γ下降,Runx3基因的表达与这两个细胞因子显著相关,与哮喘的改变相似。2.外周血单个核细胞Runx3基因表达量的检测对于甄别毛细支气管炎中的哮喘高危儿具有一定价值,可作为预测毛细支气管炎发展为哮喘的生物学指标,为实现哮喘的二级预防提供依据。第二部分Runx3基因启动子区域甲基化与该基因表达水平的相关性和临床意义研究目的1.通过分析毛细支气管炎外周血单个核细胞中Runx3基因甲基化与该基因表达水平的相关性,探讨在毛细支气管炎中Runx3基因表达的调控机制。2.评估Runx3启动子区域Cp G岛甲基化在毛细支气管炎中变化的意义。实验方法按分层随机原则收集具有特应性体质的毛细支气管炎患儿(Ba组)13例,非特应性体质的毛细支气管炎患儿(Bn组)14例。对照组也按分层随机原则纳入在本院同期体检的同年龄段健康儿童,分别为特应性对照组(Ca组)12例及非特应性对照组(Cn组)12例。取供者外周血3 ml常规抗凝,使用人外周淋巴细胞分离液提取PBMC后再用DNA试剂盒提取完整的DNA样本,备检Runx3启动子区域甲基化状态。使用Methyl Target TM目标区域甲基化测序技术检测Runx3基因启动子区甲基化状态,并验证四组不同基因位点的甲基化差异。实验结果1.各组Runx3基因启动子区域平均甲基化程度(1)Ba组Runx3启动子区平均甲基化率为29.3%;(2)Bn组Runx3启动子区平均甲基化率为28.8%;(3)Ca组Runx3启动子区平均甲基化率为28.4%;(4)Cn组Runx3启动子区平均甲基化率为28.4%。2.通过检测Runx3基因启动子区域307个Cp G位点中各组Runx3启动子甲基化程度(1)Ba组显著高于Ca组的甲基化位点共有13个;(2)Ba组显著高于Cn组的甲基化位点共有24个;(3)Ba组显著高于Bn组的甲基化位点共有7个;(4)Bn组显著高于Ca组的甲基化位点共有1个;(5)Bn组显著高于Cn组的甲基化位点共有16个;(6)Ca组显著高于Cn组的甲基化位点共有11个;(7)B组显著高于C组的甲基化位点共有23个;(8)a组(atopic group,Ba+Ca)显著高于n组(non-atopic group,Bn+Cn)的甲基化位点共有12个。3.不同组别中Runx3启动子区域差异性甲基化位点情况(1)有6个位点(Chr1:25258404、Chr1:25258406、Chr1:25258412、Chr1:25258416、Chr1:25258418、Chr1:25258426)的甲基化在Ba/Ca、Ba/Cn、Ba/Bn、Bn/Ca、Bn/Cn、Ca/Cn、B/C、a/n各组比较中具有显著差异;(2)有3个位点(Chr1:25258257、Chr1:25258264、Chr1:25258402)的甲基化在Ba/Ca、Ba/Cn、Bn/Cn、Ca/Cn、B/C、a/n各组比较中具有显著差异;(3)有1个位点(Chr1:25258384)的甲基化在Ba/Ca、Ba/Cn、Ba/Bn、B/C、a/n各组比较中具有显著差异;(4)有1个位点(Chr1:25258613)的甲基化在Ba/Ca、Ba/Cn、B/C各组比较中具有显著差异;(5)有3个位点(Chr1:25257392、Chr1:25258479、Chr1:25258633)的甲基化在Ba/Cn、Bn/Cn、B/C各组比较中具有显著差异;(6)有1个位点(Chr1:25258289)的甲基化在Ba/Cn、Ca/Cn、a/n各组比较中具有显著差异;(7)有6个位点(Chr1:25258485、Chr1:25258531、Chr1:25258546、Chr1:25258557、Chr1:25258623、Chr1:25258673)的甲基化在Ba/Cn、B/C组比较中具有显著差异;(8)有1个位点(Chr1:25258221)的甲基化在Ba/Cn、a/n各组比较中具有显著差异;(9)有1个位点(Chr1:25257629)的甲基化在Ba/Ca、B/C组比较中具有显著差异;(10)有2个位点(Chr1:25258537,Chr1:25258568)的甲基化在Bn/Cn、B/C各组比较中具有显著差异;(11)有2个位点(Chr1:25258654,Chr1:252586798)的甲基化在Ba/Cn组比较中具有显著差异;(12)有1个位点(Chr1:25258136)的甲基化在Ba/Ca组比较中具有显著差异;(13)有1个位点(Chr1:25257308)的甲基化在Bn/Ca组比较中具有显著差异;(14)有2个位点(Chr1:25257217,Chr1:25257229)的甲基化在Bn/Cn组比较中具有显著差异;(15)有1个位点(Chr1:25258390)的甲基化在Ca/Cn组比较中具有显著差异。4.各组中Runx3启动子区域显著甲基化位点个数:Ba组26个,Bn组17个,Ca组11个,Cn组0个,B组23个,a组12个。其中Ba组发生显著甲基化的位点个数显著高于Ca组、Cn组;Bn、Ca组发生显著甲基化的位点个数显著高于Cn组;B组发生显著甲基化的位点个数高于C组;a组发生显著甲基化的位点个数高于n组。P值均<0.01。5.Runx3基因启动子Cp G位点甲基化与该基因表达水平的相关性(1)Ba/Cn组Runx3基因启动子24个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈显著负相关,P<0.05。(2)Ba/Bn组Runx3基因启动子7个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈显著负相关,P<0.05。(3)Ba/Ca组Runx3基因启动子13个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈负相关,但是相关性不显著。(4)Bn/Cn组Runx3基因启动子16个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈显著负相关,P<0.01。(5)Ca/Cn组Runx3基因启动子11个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈显著负相关,P<0.05。(6)B/C组Runx3基因启动子23个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与该基因的表达水平呈显著负相关,P<0.01。6.Runx3基因启动子Cp G位点甲基化与血清细胞因子IL-4、IFN-γ浓度的相关性(1)Ba/Cn组Runx3基因启动子24个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈显著正相关,与血清IFN-γ浓度呈显著负相关,P均<0.05。(2)Ba/Bn组Runx3基因启动子7个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈显著正相关,与血清IFN-γ浓度呈显著负相关,P均<0.05。(3)Ba/Ca组Runx3基因启动子13个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈正相关,与血清IFN-γ浓度呈负相关,但相关性均不显著。(4)Bn/Cn组Runx3基因启动子16个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈显著正相关,与血清IFN-γ浓度呈显著负相关,P均<0.05。(5)Ca/Cn组Runx3基因启动子11个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈显著正相关,P<0.05;与血清IFN-γ浓度呈显著负相关,P<0.01。(6)B/C组Runx3基因启动子23个高甲基化Cp G位点的平均甲基化水平与血清IL-4浓度呈显著正相关,与血清IFN-γ浓度呈显著负相关,P均<0.01。实验结论1.毛细支气管炎中的哮喘高危儿更容易出现Runx3基因启动子的甲基化。Runx3基因启动子Cp G位点甲基化通过对该基因表达的影响,在毛细支气管炎尤其是特应性体质毛细支气管炎患儿的Th1/Th2失衡中发挥了作用。2.Runx3基因启动子区域Chr1:25258654,Chr1:252586798、Chr1:25258136、Chr1:25258384这四个Cp G位点显著甲基化仅见于特应性体质毛细支气管炎患儿,因此可以作为鉴别毛细支气管炎中哮喘高危儿的特征性相关位点,为甄别和干预毛细支气管炎中哮喘高危儿提供了新的思路和途径。