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石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)是一种高效中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂,可应用于轻中度阿尔茨海默病的治疗。石杉科植物如千层塔是石杉碱甲的主要天然来源,但是由于资源短缺,组织培养难度过大,人工合成步骤繁琐及高成本限制了石杉碱甲产业的发展。植物内生真菌因其生长周期短、易于培养且低成本等优点,渐渐成为了研究植物次生代谢产物合成的热点,为HupA生物合成研究提供了新思路。随着近年来表观遗传学研究的发展,表观调控在真菌研究领域显示出巨大潜力。表观遗传学指染色体DNA序列不发生改变的情况下,基因表达发生了可遗传的变化,从分子机制角度来看表观遗传调控是由环境因素引起的生物细胞内遗传物质发生了化学结构修饰,主要包括DNA甲基化,组蛋白修饰,RNA干扰等几个方面,这些调节模式极易受到环境的影响。HupA作为胶包炭疽次生代谢产物,其产量的积累受环境因素所调控,因此研究表观遗传对胶包炭疽合成HupA影响并阐释产量积累的分子机制具有重要的科学意义。目前对真菌的表观研究手段主要是通过基因工程敲除或过表达相关表观修饰基因,或者利用小分子表观遗传试剂两个方面。本课题组在前期工作中从千层塔中分离出具有产HupA能力的内生真菌胶胞炭疽Cg01,随后完成了该菌的基因组和转录组测序及基因功能注释,获得了组蛋白赖氨酸甲基化转移酶(histone methyltransferase,HMT)、组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)等表观调控相关基因。本研究通过小分子表观遗传抑制剂,基因敲除,RNA测序(RNA-seq),染色质免疫共沉淀联合高通量测序(Chip-seq)等试验探究了表观遗传在千层塔内生真菌合成石杉碱甲的调控作用,奠定石杉碱甲体外生物合成基础。获得的主要研究结果如下:1、通过在内生真菌发酵过程中添加两种小分子表观遗传抑制剂,分别是DNA甲基转移酶抑制剂—5-杂氮胞苷(5-Azacytidine,5-AC);组蛋白去乙酰化酶抑制剂—丙戊酸钠(Sodium Valproate,SV)、烟酰胺(Nicotinamide,NIC)、丁酸钠(Sodium butyrate,SB)、曲古柳菌素(TrichostatinA,TSA)探究对Cg01生物量及合成HupA的影响。SV和NIC添加HupA产量显著降低,而SB组HupA产量显著升高,其余无影响。2、采取PEG介导的同源重组转化法,对筛选获得的4个表观遗传相关候选基因进行敲除与回补,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲产量。结果显示基因敲除突变体菌株CgMst2石杉碱甲产量无影响,敲除CgClr4及CgSir2和CgClr3石杉碱甲产量分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。对石杉碱甲有影响的三个基因进行回补,突变体菌株在相应回补基因表达均与野生型无显著性差异情况下,其石杉碱甲产量回复到野生型水平。3、采用Western blot和酶活性测定试验鉴定了CgClr4和NIC的功能,发现两者均有效降低Cg01组蛋白甲基化H3K9me2水平,以及发生在组蛋白H3K9点位甲基化酶的活性,说明了在Cg01 H3K9点位二甲基化是一种重要的甲基化修饰方式,且NIC和CgClr4通过降低该位点甲基化,从而调控石杉碱甲的合成。4、通过RNA-seq探究关联基因转录水平并联合Chip-seq分析得到可能的石杉碱甲合成相关基因:如Cg01-09994(乙醇脱氢酶)、Cg01-03750(细胞色素c过氧化物酶)等。