山羊血管紧张素转换酶2(ACE2)的克隆表达及抗体制备

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本研究通过克隆山羊血管紧张素转换酶2(ACE2)基因,构建表达载体进行蛋白表达,制备鼠抗ACE2多克隆抗体。研究包括以下三个方面的内容:1山羊ACE2基因的克隆与生物信息学分析试验取山羊肾脏组织,利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到pMD19-T载体并转到大肠杆菌DH5a感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。结果:山羊ACE2基因mRNA编码区共包括2415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比较发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2预测序列最高为99%,与斑马鱼最低仅为60%。遗传进化分析发现该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上,与羊在其他基因遗传进化上的规律相符。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1aa-18aa之间,蛋白跨膜螺旋预测为I型跨膜蛋白。结论:本实验首次成功克隆了山羊ACE2全基因序列,并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,所得序列已上传GenBank,基因序列号为KF921008.1。2山羊血管紧张素转化酶2(ACE2)蛋白的原核表达根据测序分析结果设计引物,以pMD19-ACE2为模板,通过PCR扩增出ACE2胞外区基因的特异性条带,对扩增产物进行纯化后,分别与经过双酶切的载体pET28a和pET3 2a酶切连接,转化到感受态BL21(DE3)细胞,构建原核表达载体pET28a-ACE2和pET32a-ACE2,挑选单克隆菌落,经过PCR和酶切验证后测序。对测序正确的单克隆菌落,使用0.25mM IPTG,28℃C诱导表达ACE2蛋白16h,应用SDS-PAGE和Western-Blot方法测定表达蛋白的大小和免疫原性。ACE2蛋白主要以包涵体的形式表达在菌体沉淀中。对包涵体蛋白进行洗涤、变性、纯化、复性处理。对细菌裂解离心后的沉淀和上清进行SDS-PAGE鉴定,结果与对照组相比,pET28a-ACE2阳性克隆菌菌体沉淀中在90kDa左右明显多出一条蛋白条带,pET32a-ACE2在100kDa左右多出一条蛋白条带,上清中没有明显变化,表明表达的ACE2蛋白主要以包涵体的形式存在。对沉淀蛋白进行Western Blot验证,表达蛋白具有与抗体结合的特性。3山羊ACE2多克隆抗体的制备及生物学鉴定利用纯化后的pET28a-ACE2表达的重组ACE2蛋白作为抗原制备山羊ACE2多克隆抗体。选用清洁级大鼠10只,多次皮下注射纯化的重组ACE2蛋白免疫大鼠,0.8mL/只。免疫4周后,抗体测定结果均为阳性,宰杀大鼠,分离血清获得多克隆鼠抗ACE2抗体。采用ELISA法测抗体效价,确定所制备抗体的最佳包被浓度和最佳稀释度;Western-Blot和免疫组化法检测其特异性及细胞内初步定位。结果:经ELISA方法,确定该抗原最佳包被浓度为0.6μg/mL,所得鼠抗ACE2血清均为免疫阳性,最佳稀释度为1:200。Western-Blot分析表明制备的该鼠抗ACE2多克隆抗体具有较好的特异性,有单一 ACE2蛋白条带出现。通过免疫组化检测表明山羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠和结肠均有ACE2蛋白的阳性分布,也间接证明了该制备抗体的特异性。本研究通过克隆、表达、多次免疫成功获得山羊ACE2多克隆抗体,该抗体具有良好效价和特异性,可用于进一步的研究。
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