调控寡孢节丛孢捕食器官形成的lncRNAs及其潜在靶基因研究

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寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)在秀丽隐杆线虫的诱导下,能产生捕食器官(三维菌网)捕捉线虫,生活模式也由此从腐生转变为寄生。目前,人们对于其捕食器官产生的分子机制有了一定的了解,但对于lncRNAs在捕食器官形成过程中的作用仍然知之甚少。基于此,本研究选取在寡孢节丛孢捕食器官形成关键节点中有差异表达的lncRNAs及其潜在靶基因进行功能研究,期望从RNA水平探究寡孢节丛孢捕食器官形成的分子机制。首先,利用同源重组的方法对在捕食器官形成过程中具有差异表达的lncRNAs-TCONS00316346及其邻近基因AOLs00193g129进行敲除,表型对比实验发现ΔTCONS00316346和ΔAOLs00193g129产捕食器官的数量与野生型菌株相比显著减少,提示它们可能参与了捕食器官的形成。RT-PCR结果显示,TCONS00316346敲除后,AOLs00193g129的表达量明显上调,提示它们之间可能存在一定的相互作用。鉴于AOLs00193g129是一个bZIP转录调控因子,其可对下游的靶基因进行调控,因此,本研究进一步对敲除菌株进行了转录组高通量测序,并通过生物信息学分析预测了可能受lncRNAs-TCONS00316346及转录调控因子AOLs00193g129共同调控的下游靶标基因,GO分析提示这些基因主要集中在新陈代谢过程、细胞膜成分和催化活性上,本研究为今后进一步深入研究lncRNAs-TCONS 00316346与转录调控因子AOLs00193g129的相互作用机制奠定了基础。鉴于部分lncRNAs能作为竞争性内源RNA(ceRNA)吸附milRNA从而调控功能基因的表达。而通过生物信息学预测发现lncRNA-LNC000315和功能基因AOLs00215g45的3’-UTR序列上具有相同的milRNA结合位点,且lncRNA-LNC000829和功能基因AOLs00210g77的3’-UTR序列上也具有相同milRNA结合位点。而RT-PCR结果显示lncRNA和功能基因在捕食器官形成过程中具有相同的表达趋势,且表达趋势与milRNA相反,推测这些lncRNAs可能与milRNA相互作用从而调控功能基因的表达。因此,本研究选取LNC000315、LNC000829、AOLs00215g45、AOLs00210g77进一步开展其功能研究。敲除LNC000315和AOLs00215g45后,表型分析发现在ΔLNC000315中生长速率及抗逆无明显变化,但产孢数量、杀线虫活性和产捕食器官数量明显减少,但在ΔAOLs00215g45中,生长速率及抗逆性、产孢数量、杀线虫活性和产捕食器官数量均无明显变化。双荧光素酶报告基因实验分析并未进一步证实LNC000315和AOLs00215g45的3’-UTR与milRNA505、milRNA544之间是否存在相互作用。此外,敲除LNC000829后,表型分析发现在ΔLNC000829中生长速率及抗逆性无明显变化,但产孢数量、杀线虫活性和产捕食器官数量明显减少,提示其在捕食器官形成过程中具有重要作用。但遗憾的是,本研究并未获得AOLs00210g77的敲除菌株,且双荧光素酶报告基因实验并未证实AOLs00210g77的3’-UTR序列与milRNA存在明显的相互作用。因此,虽然本研究初步证实LNC 000315和LNC000829在捕食器官形成过程中可能具有重要的作用,但其是否确实通过与milRNA形成内源性竞争RNA来调控功能基因,从而参与捕食器官的形成还有待进一步研究。本论文的创新性:本研究利用分子生物学手段对在捕食器官形成过程中可能发挥调控作用的lncRNAs及其靶基因开展研究,从非编码RNA调控的角度理解捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制。
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