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肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子，其最显著的活性特征是可以在体内或体外特异性的杀伤多种肿瘤细胞，是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。TNF的临床研究曾在许多国家展开，但因其全身用药毒副作用太大而限制了临床应用。随着分子生物学技术的飞速发展，应用基因工程手段制备高效低毒的TNF突变体呈现出较好的应用前景。
目的：
1.将本课题组构建好的带有胶原蛋白(collagen)序列，胶原酶(MMP-1和MMP-8)底物序列和hTNF-a突变体基因的两种表达质粒转化入大肠杆菌Rosseta2(DE3)中，实现高效表达2.确定rhTNF-a融合基因表达的优化方案。
3.初步确立rhTNF-a融合基因表达产物的纯化方案，获得两种rhTNF-a融合蛋白的初步纯化产物。
4.验证基质金属蛋白酶(MMP-1和MMP-8)对融合蛋白的去封闭效果。
方法：
1.重组质粒pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF的转化及鉴定将重组pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF表达质粒，分别转入大肠杆菌Rosseta2(DE3)中，筛选阳性重组子并进行电泳鉴定、DNA序列分析。
2.rhTNF-a融合蛋白的诱导表达及提取用IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导融合蛋白的表达，按Novagen公司BugBusterHis.Bind Purification Kits试剂盒方法分别提取可溶性蛋白和包涵体蛋白。用SDS-PAGE初步鉴定融合蛋白是否表达以及融合蛋白的大小和表达形式。
3.蛋白表达条件的优化在蛋白基本表达的基础上，对表达菌株、诱导温度、诱导剂浓度及表达时间等条件进行优化，收集蛋白进行样品处理及分析。
4.蛋白纯化
1)按Novagen公司BugBuster His.Bind Purification Kits试剂盒方法进行镍凝胶亲和层析，分别进行小量分批和大量纯化融合蛋白，SDS-PAGE初步鉴定融合蛋白的纯化产物。
2)透析
3)纯化蛋白总含量的测定按Bradford酶标板蛋白测定法检测纯化产物的含量。
4)肠激酶切除载体标签5)凝胶过滤层析分离纯化目的蛋白5.基质金属蛋白酶对融合蛋白的去封闭效果研究结果：
1.确立了重组pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF质粒在大肠杆菌Rosseta2(DE3)的表达条件，获得两种rhTNF-a融合基因的表达产物。
2.对融合蛋白的表达条件进行了优化，确定了可溶性蛋白的表达条件，实现了高效表达。
3.建立了融合蛋白的初步纯化方案，获得两种rhYNF-a融合蛋白的初步纯化产物，但纯化条件还不成熟，有待进一步的摸索。
4.成功切除了融合蛋白上的载体标签，为进一步实验打好基础。
5.验证了基质金属蛋白酶(MMP-1和MMP-8)对融合蛋白的去封闭效果。
6.由于时间的限制未能进一步进行获得大量高纯度的有活性的目的蛋白。因此，尚无法确定所得到的蛋白是否有抗肿瘤活性及其靶向性的优劣。
结论：
本实验利用基因工程技术对hTNF-a进行了表达纯化，对rhTNF-a在大肠杆菌系统表达的条件以及表达产物的提取纯化方法进行了优化。为下一步获得有活性的rhTNF-a融合蛋白及其活性检测奠定基础，也为进一步研究开发新型高效低毒抗肿瘤药物提供新的思路和方法。本实验尚未获得大量高纯度的rhYNF-a融合蛋白，同时融合蛋白的纯化方案也需要进一步改进和完善。