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第一部分circSTAG1调节小鼠抑郁样行为目的:重度抑郁症是一种复杂的非器质性精神疾病,具有高患病率、复发率和致残率的特征,目前已成为全球范围内第二大致残疾病。经典的抗抑郁药物存在起效慢、副作用大以及个体差异大等缺点,新型抗抑郁药物开发迫在眉睫。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是中枢神经系统高表达的一类特殊RNA分子。现有研究表明,circ RNA参与调控人类多种疾病,但抑郁症中的circ RNA作用却少有报道。为探明抑郁症的发病机制,寻求抑郁症新的药物治疗靶点,本节我们将探讨环状RNA STAG1（circular RNA STAG1,circSTAG1）的抗抑郁作用。方法:（1）circ RNA测序分析慢性不可预知刺激（chronic unpredictable stimulation,CUS）模型小鼠海马脑区差异变化的circ RNA;（2）实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,q PCR）检测小鼠血浆、全血以及海马脑区中的circ RNA表达;（3）q PCR检测人血浆和全血中的circ RNA表达;（4）q PCR检测小鼠海马脑区以及人外周血样本STAG1信使RNA（message RNA,m RNA）表达;（5）使用慢病毒载体过表达小鼠circSTAG1;（6）体外培养293T细胞并转染鼠源circSTAG1慢病毒,琼脂凝胶电泳检测鼠源circSTAG1在293T细胞中的表达情况;（7）c DNA双端引物测序确认外源性circSTAG1的成环情况;（8）利用脑立体微注射技术,注射circSTAG1慢病毒至小鼠海马脑区,观察小鼠抑郁样行为。结果:（1）CUS小鼠海马中circSTAG1、circ KALRN、circ DOCK-1以及circ DOCK-2表达下调;（2）circSTAG1在CUS小鼠海马、血浆以及全血样本中表达下调;（3）circSTAG1在抑郁病人血浆和全血样本中表达下调;（4）在CUS小鼠海马和抑郁病人全血中,STAG1 m RNA表达并未发生改变;（5）在离体细胞中,circSTAG1慢病毒能够有效过表达circSTAG1;（6）海马脑区脑微注射circSTAG1慢病毒可以改善CUS小鼠抑郁样行为。结论:circSTAG1在抑郁病人和CUS小鼠样本中表达下调;海马脑区过表达circSTAG1,能够抑制CUS小鼠抑郁样行为。第二部分circSTAG1通过ALKBH5调节小鼠抑郁样行为目的:circ RNA参与疾病调控方式十分复杂,为探明circSTAG1发挥抗抑郁作用的具体机制,我们试图寻找circSTAG1的下游分子。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰是m RNA内部最为丰富的化学修饰,参与人类多种疾病进程。然而抑郁症和m6A甲基化修饰的关系却并不清楚。本部分工作有助于了解circSTAG1和RNA m6A修饰在抑郁中的潜在作用,探索两者间的上下游调控关系,同时也为抑郁症治疗策略提供新的思路。方法:（1）流式细胞术分选脑内星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元,q PCR检测circSTAG1变化;（2）蛋白质印迹法（western blot,WB）检测小鼠海马脑区星形胶质细胞标记物GFAP和去甲基化酶ALKBH5表达情况;（3）二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）法结合sholl分析测定星形胶质细胞数量和形态;（4）比色法检测RNA m6A甲基化修饰水平;（5）星形胶质细胞转染circSTAG1过表达病毒以及circSTAG1小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）,并使用WB检测甲基化酶METTL3、METTL1和WTAP以及去甲基化酶ALKBH5和FTO表达情况,确认circSTAG1对甲基化酶和去甲基化酶的调控作用;（6）cat RAPID算法预测ALKBH5和circSTAG1的结合区域;（7）RNA结合蛋白免疫沉淀以及RNA下拉实验证实circSTAG1和ALKBH5的相互作用;（8）细胞质和细胞核分离以及免疫荧光实验,确认ALKBH5的亚细胞分布;（9）构建ALKBH5短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）慢病毒,并采用脑立体微注射方式注射至海马脑区,观察小鼠抑郁样行为是否改变。结果:（1）CUS小鼠星形胶质细胞circSTAG1表达显著降低;（2）海马脑区过表达circSTAG1,缓解CUS模型引起的星形胶质细胞异常状态;（3）海马脑区过表达circSTAG1,抑制CUS模型引起的m6A甲基化水平降低;（4）在离体水平,过表达或敲低circSTAG1并不影响RNA m6A酶表达;（5）circSTAG1能够结合ALKBH5,而并不结合其它m6A甲基化酶和去甲基化酶;（6）删除ALKBH5结构域或突变circSTAG1序列均可抑制两者结合;（7）circSTAG1调节ALKBH5亚细胞分布;（8）小鼠海马脑区注射ALKBH5 sh RNA慢病毒能够抑制CUS小鼠抑郁样行为。结论:过表达circSTAG1能够抑制CUS模型引起的星形胶质细胞功能异常;circSTAG1通过与ALKBH5的结合,降低ALKBH5的入核,而敲低ALKBH5表达,缓解CUS小鼠抑郁样行为。第三部分circSTAG1/ALKBH/FAAH轴调控星形胶质细胞存活目的:为明确m6A甲基化修饰在抑郁症中的作用,进一步阐明ALKBH5在抑郁症中的具体调控机制,我们试图探寻ALKBH5的下游靶分子。本部分为ALKBH5参与抑郁症调控提供具体分子生物学证据,同时给抑郁症治疗提供了新策略。方法:（1）m6A测序检测CUS小鼠脑内海马区转录本m6A水平;（2）WB检测ALKBH5和FAAH表达水平;（3）KEGG富集分析筛选下游FAAH;（4）SRAMP在线工具预测FAAH m RNA m6A修饰位点;（5）q PCR检测FAAH m RNA以及m6A修饰的FAAH m RNA碎片;（6）荧光素酶报告基因实验验证ALKBH5对FAAH m RNA的作用;（7）体外使用皮质酮模拟抑郁症中星形胶质细胞缺失状态;（8）CCK8检测皮质酮处理以及circSTAG1/ALKBH5/FAAH基因干扰或过表达对星形胶质细胞活力的影响。结果:（1）CUS小鼠海马m RNA发生异常m6A修饰,集中于3’非翻译区（untranslated region,UTR）;（2）CUS小鼠海马脑区FAAH m RNA 3’UTR m6A修饰水平显著降低,敲低ALKBH5促进FAAH m RNA 3’UTR m6A甲基化;（3）CUS小鼠海马脑区FAAH m RNA和蛋白表达上调,敲低ALKBH5抑制FAAH m RNA和蛋白表达水平;（4）circSTAG1通过ALKBH5抑制FAAH表达;（5）皮质酮模型下,下调的circSTAG1通过ALKBH5促进下游基因FAAH表达,加重星形胶质细胞死亡。结论:circSTAG1通过ALKBH5上调靶基因FAAH m RNA m6A水平,从而抑制FAAH表达。皮质酮通过circSTAG1/ALKBH5/FAAH轴影响星形胶质细胞存活。