论文部分内容阅读
植物次生代谢物白藜芦醇(resveratrol，简称Res)是一种植物保护素，对病原菌有防御作用。研究发现，Res具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病等保健功能，但在植物中Res含量非常低微，Res的生物合成机制已经阐明，因此利用微生物异源表达Res已成为可能。Res的生物合成由苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)和白藜芦醇合酶(RS)催化完成，其中白藜芦醇合酶是Res生物合成中最关键的酶，负责催化1分子香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A生成Res。本研究从葡萄和大豆中克隆了白藜芦醇生物合成所需的所有关键酶基因，使用香菇gpd启动子构建了三个食用菌表达载体，利用PEG介导原生质体的方法转化高等真菌灰盖鬼伞，研究白藜芦醇合酶基因在灰盖鬼伞中的异源表达。主要研究结果如下： (1)葡萄pal基因全长cDNA序列及完整DNA序列的克隆。利用PCR技术从葡萄基因组DNA中克隆了完整的pal基因DNA序列，共2579bp，登录号为JN858963；根据DNA序列设计特异引物，采用外显子拼接技术获得pal基因全长cDNA序列，共2241bp，登录号为JN858957，包含一个2133bp的开放阅读框，编码710个氨基酸残基，相对分子质量77.04k，等电点6.13，属细胞色素P450超家族。 (2)大豆c4h基因全长cDNA序列的克隆。利用RT-PCR技术克隆了大豆的c4h基因cDNA序列，全长1764bp，登录号为JN858958，包含1521bp的开放阅读框，编码506个氨基酸残基，相对分子质量为58.01kD，等电点为9.05，属细胞色素P450超家族。 (3)葡萄4cl基因全长cDNA序列的克隆。利用RT-PCR技术克隆了葡萄4cl基因cDNA序列，全长1720bp，登录号为JN858959，包含1713bp的开放阅读框，编码570个氨基酸残基，相对分子质量61.88，等电点5.53，属AMP结合酶酶超家族。 (4)葡萄rs基因全长cDNA序列及完整DNA序列的克隆。运用PCR、RT-PCR及外显子拼接法从葡萄中克隆了rs基因全长DNA序列和vrs1、vrs2、vrs3三个全长cDNA序列，登录号分别为JN858964、JN858960、JN858961、JN858962。RS基因DNA序列全长1610bp，包含一个内含子：vrs1、vrs2和vrs3全长分别为1257bp、1183bp、1241bp，都包含一个1179bp的开放阅读框，编码392个氨基酸。同源性分析表明，vrs1、vrs2、vrs3序列相似性最低为97.58％，其编码的氨基酸序列一致性最低为98.72%。 (5)真核表达载体的构建。分别将vrs1、vrs2、vrs3序列与香菇小片段gpd启动子连接，以表达载体pBluescriptⅡ KS(+)为框架，构建真核表达载体。重组质粒经过酶切和测序鉴定后，将构建成功的载体命名为pgLes-vrs1、pgLes-vrs2，pgLes-vrs3。 (6)rs基因在灰盖鬼伞中异源表达的研究。采用PEG介导法分别将表达载体pgLes-vrs1、pgLes-vrs2、pgLes-vrs3与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中，经过选择培养基筛选，验证获得假定转化子31株；通过PCR、RT-PCR、Southern杂交和SDS-PAGE鉴定，获得15个阳性转化子。对部分阳性转化子的发酵产物进行HPLC分析，结果显示，虽然没有目标产物白藜芦醇及白藜芦醇苷的生产，但转化子与灰盖鬼伞原种的发酵液在成分和含量上有所区别。