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基因选择性剪接是控制基因表达和产生蛋白功能多样性的重要机制,它在发育、分化和癌症等过程中都发挥着相当重要的作用。基因选择性剪接的异常往往会导致遗传疾病甚至是癌症的发生,人类癌症基因中有很大一部分与基因的选择性剪接调控有关,而癌症特异性的剪接变体又具有一定的诊断和作为特异性治疗靶点的应用价值,这使得癌症与基因选择性剪接的研究成为当今热点。研究表明,基因选择性剪接能以多种方式导致癌症的发生,因此深入探究剪接变体在癌症发生中的变化形式及其功能作用可以为今后肿瘤的早期诊断和治疗奠定理论基础,同时为癌症的治疗方法提供新的思路。Kiaa1217是一个比较新的基因,关于它的研究并不多,目前主要是针对椎间盘突出和融合基因方面。本实验室前期研究中通过第二代测序分析技术,比较9种癌症组织和相应正常组织中差异表达的基因选择性剪接变体时,发现Kiaa12 17基因在肝癌、肺癌和乳腺癌等癌症中存在变体的差异表达。但Kiaa1217基因及其变体在肿瘤细胞中的存在形式以及在肿瘤的的发生发展中具有怎样的作用,还尚不清楚。鉴于此,在本实验研究中,我们根据NCBI数据库确定了Kiaa1217基因存在7种变体,并通过设计不同引物,利用RT-PCR的方法初步区分Kiaa1217基因的各不同变体,进而在不同的细胞系中检测变体的表达情况并开展相关的功能活性研究。取得的主要结果如下:1.采用RT-PCR方法在多种细胞系中分析Kiaa1217基因变体的表达情况,发现在不同种类的肿瘤细胞或同一种类的不同肿瘤细胞系中,Kiaa1217基因mRNA选择性剪接变体的表达方式呈多样性;2.RT-PCR结合DNA测序,首次发现一种新型的Kiaa1217基因变体,将其命名为V9,它与变体V6极为相似,只是缺少长度为78bp的外显子18;3.通过利用不同引物进行RT-PCR分析和PCR扩增Kiaa1217基因组片段,初步确认在人卵巢癌细胞SKVO3中,Kiaa1217基因很可能是以融合基因的形式存在。4.与人正常肝细胞L02相比,人肝癌细胞Bel-7402中Kiaa1217 V4/5变体呈高表达。据此,利用siRNA技术,干涉Bel-7402细胞中Kiaa1217 V4/5以及总Kiaa1217的表达,来探究Kiaa1217及其V4/5变体在肝癌中的生物学功能。(1)采取MTT的方法检测细胞活力发现,siRNAs干涉Kiaa1217 V4/5及总Kiaa1217的表达后明显抑制人肝癌细胞Bel-7402的细胞活力;(2)联合应用DAPI染色法观察凋亡小体和AnnexinV-FITC/PI双染细胞流式分析法分析凋亡细胞的比例,证明总Kiaa1217及其V4/5变体的表达下降促进了Bel-7402细胞发生凋亡。进一步的蛋白免疫印迹分析显示,总Kiaa1217及其V4/5变体的表达下降增加了活化的caspase cleved-9和caspase-3水平,同时下调了Bcl-2/Bax的表达比率,提示Kiaa1217 V4/5及总Kiaa1217的表达下调可通过激活线粒体凋亡途径来诱导人肝癌细胞Bel-7402细胞发生凋亡的;(3)联合应用Brdu掺入法、软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验证明总Kiaa1217及其V4/5变体的表达下降对Bel-7402细胞的增殖能力没有影响,进一步的流式细胞术分析细胞周期及Western Blot分析周期相关蛋白亦证明上述结论;(4)利用划痕实验、transwell小室实验证明干涉总Kiaa1217及其V4/5变体的表达后,Bel-7402的迁移能力明显下降;进一步利用Western Blot方法分析EMT相关标志蛋白的表达时发现总Kiaa1217及其V4/5变体的表达下调可促进E-cadherin蛋白表达,同时抑制N-cadherin、Vimentin和MMP9的表达,提示EMT过程受到抑制,这可能是导致Bel-7402的迁移能力下降的机制之一。总之,本研究首次分析了Kiaa1217基因选择性剪接变体在肿瘤细胞中的表达形式,并首次揭示了Kiaa1217及其变体在肿瘤细胞中的生物学作用,这可能为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的思路。