研究目的和背景:肝癌是全球范围内最常见的侵袭性恶性肿瘤之一。在我国,肝癌的发病率在所有肿瘤中居于第三位,死亡率更是高居第二,并有逐年上升的趋势,已对广大人群的生命健康造成极大的危害。肝癌包含众多亚型,而肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作为原发性肝癌中最主要的一种亚型,其比例占全球肝癌的比例约70%-85%。同时,HCC的预后效果往往很差,因为大部分患者被诊断出患有癌症时已处于晚期,或经历手术切除后常见复发和转移。近些年来,随着基因组学研究的不断深入以及大量靶向治疗药物的临床应用,使得HCC的治疗逐渐转向以基因为主导方向的个体化靶向治疗。以前,人们主要着重研究HCC的相关编码基因,随着深入研究人们慢慢发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在癌症的发生与发展过程中也是有着举足轻重的作用,同时也发现lncRNA的组织特异性和在癌症中的异常表达使其成为癌症的临床诊断和预后评估的新的生物标志物。此外,随着高通量基因检测技术的发展和生物信息学分析方法的兴起,使得人们发现了越来越多的lncRNAs在HCC中显著失调。本研究的主要目的是通过对基因芯片数据的挖掘筛选出在HCC中表达显著异常的lncRNAs,并对其在HCC中的临床诊断、预后评估、生物功能以及作用机制方面展开深入研究。研究方法:1.通过对Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中的基因芯片数据整合挖掘,筛选出在HCC中显著差异表达的lncRNAs。2.利用HCC的组织、细胞、血清样本对筛选出的lncRNAs进行实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)实验验证。3.分析在HCC的临床血清诊断中具有潜在价值的lncRNAs。4.利用 R 语言分析 The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中的 RNA-Seq数据,分析差异表达的lncRNAs对HCC总体生存率的影响。5.利用LINC01419 Smart Silencer瞬时干扰肝癌细胞株,构建LINC01419低表达的细胞模型。6.通过Transwell侵袭实验、迁移实验、CCK-8实验、流式细胞周期和凋亡实验研究LINC01419对肝癌细胞生物功能的影响。7.利用lncLocator软件预测LINC01419在肝癌细胞中的定位。8.分离提取肝癌细胞株胞质和胞核中的总RNA,利用qRT-PCR方法检测LINC01419在肝癌细胞中的分布情况。9.利用生物信息学软件miRDB、DIANA和miRCode预测可能与LINC01419靶向结合的微小RNA(microRNAs,miRNAs)。10.利用qRT-PCR方法检测LINC01419干扰前后miRNAs的表达水平,分析相关性。11.利用RNA22 v2软件预测LINC01419与miRNA的结合位点。12.构建LINC01419双荧光素酶野生型和突变型质粒载体并测序验证。13.进行双荧光素酶报告基因检测分析,验证LINC01419与miRNA的结合位点。研究结果:一、通过GEO数据库挖掘HCC中显著差异表达的lncRNAs及验证分析1.通过对GEO数据库中的芯片数据整合分析,最终筛选出了 14个在HCC中具有显著差异表的lncRNAs(5个上调的lncRNAs:CRNDE,LINC01419,PTTG3P,GBAP1 和 CHL1-AS1;9 个下调的 lncRNAs:A2M-AS1,CYP2B7P,H19,HAND2-AS1,LINC01093,LINC01146,LOC101928505,LOC200772 和NAPSB)。2.通过HCC组织、细胞株和细胞培养上清液多方面对14个lncRNAs进行差异表达水平验证,qRT-PCR实验结果与GEO芯片数据挖掘结果大部分一致。3.采用TCGA数据库中的测序数据对14个lncRNAs进行差异表达验证,排除测序丰度过低的结果也是基本一致。同时利用TCGA数据库中的临床信息进行生存分析,结果显示有三个lncRNAs(CRNDE,GBAP1和LINC01093)与HCC总体生存率显著相关,但不能作为独立的影响预后的指标,因为相关性分析显示患者年龄对HCC预后也有影响。4.通过设立预试验组和确证组,发现lncRNACRNDE和LINC01419在HCC患者血清中的表达显著高于健康对照者的血清。二、LINC01419在肝癌细胞中的生物功能研究1.CCK-8法实验表明LINC01419干扰后,肝癌细胞的增殖能力减弱(P<0.05)。2.Transwell小室侵袭和转移实验表明LINC01419干扰后,肝癌细胞的侵袭和迁移能力均降低(P<0.05)。3.流式细胞术检测细胞周期和凋亡实验显示LINC01419干扰前后细胞周期和凋亡进程均无明显改变。三、肝癌细胞中与LINC01419靶向结合的miRNA的研究1.通过软件预测和细胞质与细胞核分离提取扩增实验,我们发现LINC01419主要分布在肝癌细胞的细胞质中。2.通过miRDB、DIANA和miRCode三个软件的预测,我们最终筛选出可能与 LINC01419 靶向结合的三个 miRNAs(miR-203a-3p、miR-204-5p 和miR-211-5p),然后通过qRT-PCR实验发现,在肝癌细胞中LINC01419干扰后miR-204-5p和miR-211-5p的表达水平显著升高。3.通过构建双荧光素酶质粒载体进行LINC01419双荧光素酶报告基因检测,进一步证实了 LINC01419 通过该位点(GACAGAGTGA)与 miR-204-5p和 miR-211-5p靶向结合。研究结论及意义:1.通过对GEO数据库中的芯片数据整合挖掘,我们发现了一系列的在HCC中显著异常表达的lncRNAs。2.通过HCC组织、细胞、血清样本以及TCGA数据库中测序数据验证和分析,进一步证实数据挖掘结果的准确性以及并发现了与HCC的临床血清诊断和预后评估密切相关的lncRNAs。3.通过细胞功能实验我们首次发现肝癌细胞株中LINC01419干扰后,可以显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。4.通过软件预测和实验分析我们首次发现LINC01419可以通过与miRNA-204-5p和miRNA-211-5p靶向结合从而影响肝癌细胞的生物功能。上述研究表明通过数据挖掘和实验分析我们发现了一系列的在HCC中显著异常表达的lncRNAs,并且与HCC的临床诊断和预后密切相关。其中LINC01419可以通过靶向结合miRNA-204-5p和miRNA-211-5p来影响HCC细胞的增殖、侵袭和迁移等生物进程,具有成为HCC的分子诊断标志物和肿瘤治疗靶点的潜能。