红花(Carthamus tinctorius L.)为菊科经济植物,全球分布,种植广泛,在我国的新疆、云南、安徽等地种植较多。红花的花丝含黄酮类、红花多糖、脂肪酸、木脂素类、多炔类、生物碱、甾醇等化合物,具有药用价值。同时,红花籽的不饱和脂肪酸含量较高,是优质的食用油资源。红花作为油、药两用植物具有较高的经济价值,但其生长周期长,又因病害多,不耐涝,产量受到影响。红花组织培养体系的建立,可以为选育抗病、抗逆境等优良红花品种奠定基础,并为转基因研究搭建技术平台。SERK(Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase)家族为体细胞胚胎发生受体激酶,在植物组织培养的体细胞胚发生过程中起重要作用。SERK3/BAK1是SERK家族成员,参与油菜素内脂(BR)信号转导途径、花器官脱落信号途径等。本研究通过比较不同配方培养基对不同红花外植体进行培养实验,建立了红花组织培养体系。利用生物信息学技术手段分析得到了红花中CtbBAK1基因的cDNA全长及蛋白质序列,并构建了BAK1-RNAi载体。采用荧光定量PCR分析了CtbBAK1基因在不同激素处理下红花叶片中的表达情况。研究结果如下:1.无菌苗培养过程:选取籽粒饱满的安徽红花品种的种子进行无菌苗培养。种子采用75%乙醇浸泡30s和0.1%升汞浸泡20min的方式表面灭菌。灭菌后的种子转移至MS培养基,在温度为23~25℃、光照强度为3000~5000lx的条件下培养7~9天,然后切取外植体。2.愈伤组织诱导培养基筛选:设计了HY1~HY9共9种诱导培养基,其中在HY1、HY2和HY3中加入不同浓度配比的NAA和6BA两种激素诱导愈伤,HY4未加入任何激素,HY5~HY9分别加入一定浓度的NAA、6BA、GA3、ABA、BR诱导愈伤。切取无菌苗的根、茎、叶外植体放入不同的愈伤组织诱导培养基中进行培养。结果显示,在上述9种培养基中,HY2诱导愈伤能力最好,根、茎、叶外植体的愈伤诱导率分别为100%、84.61%、88.63%;HY3次之,根、茎、叶外植体的愈伤诱导率分别为100%、60%、85.71%;在HY4、HY6和HY7中,只有根外植体有愈伤组织形成,茎、叶均没有愈伤组织形成;在HY5中,根、茎、叶外植体均有愈伤形成,而且在叶片外植体形成的愈伤组织中会有根的分化形成;在HY8和HY9中,根外植体形成的愈伤组织比HY4少,茎、叶外植体没有愈伤组织形成。3.组培苗的分化培养基筛选:将叶片诱导的愈伤组织转移至苗分化培养基中进行培养。在HM1~HM9共9种培养基中,HM1的出芽率和出苗率分别为100%和47.5%,为最优分化苗培养基;在HM2中分化苗少,但是可以产生大量愈伤组织,扩繁能力强;HM5更容易形成玻璃苗;HM4、HM6和HM9出芽率低,它们诱导形成分化苗能力较差。4.根的诱导培养基筛选:将分化苗转移至生根培养基中进行培养。HG1和HG2诱导生根率分别为84.6%和77.8%。二者对根的诱导形成均有很好的效果,但HG2更能诱导出根系发达的分化苗。5.CtbBAK1基因生物信息学分析:从红花转录组中分析得到了SERK家族中的SERK3/BAK1。其ORF长度为1782bp,经过氨基酸序列比对,命名为CtbBAK1。通过ProtParam分析其氨基酸理化性质,其等电点为5.40,分子量为65.87kDa;TMpred分析显示有两个蛋白质跨膜区域;SWISS-MODEL分析建立了该蛋白质的三级结构模型;与12个其他物种的BAK1基因比对并构建系统发育树,结果显示CtbBAK1与同为菊科的向日葵、莴苣及黄花蒿聚亲缘关系最近。6.CtbBAK1基因表达分析:采用荧光实时定量PCR法,对红花的根,茎,叶进行CtbBAK1表达量分析;在0h、3h、6h、12h、24h五个时间点,取经过HY4~HY9六种培养基(五种激素)处理的叶片进行CtbBAK1表达量分析。结果表明,CtbBAK1在红花各部位表达量依次为根>茎>叶;含NAA和6BA的培养基诱导处理叶片时,CtbBAK1上调,其它激素处理时,CtbBAK1表达量没有明显变化。